【摘要】：目的:研究細胞自噬在維持鼻咽癌CNE2干樣細胞干細胞生物特性中的功能,為進一步闡明細胞自噬在調控鼻咽癌發(fā)病中的作用提供新的實驗依據(jù)。方法:1.無血清懸浮培養(yǎng)法從鼻咽癌CNE2細胞系中誘導鼻咽癌CNE2干樣細胞(CNE2-SC):1)通過細胞分化實驗檢測鼻咽癌CNE2細胞與CNE2-SC分化能力;軟瓊脂克隆形成實驗檢測CNE2細胞和CNE2-SC克隆形成能力;2)采用流式細胞儀檢測鼻咽癌CNE2細胞與CNE2-SC的CD133陽性標記細胞比率;3)實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot(WB)檢測分析鼻咽癌CNE2細胞與CNE2-SC的干性相關基因及蛋白(Bmi-1,Twist1)表達水平;4)透射電鏡實驗觀察鼻咽癌CNE2細胞與CNE2-SC自噬小體的形成情況;5)實時熒光定量PCR和Western blot檢測分析鼻咽癌CNE2細胞與CNE2-SC的自噬相關基因及蛋白(Beclin1,LC3B)表達水平;2.Beclin1-shRNA慢病毒載體的構建和鑒定:1)設計針對Human Beclin1基因的siRNA靶標的三個靶序列和一個對照序列,合成單鏈DNA oligo片段后,將單鏈DNA oligo的正義鏈和反義鏈混合物制備成雙鏈DNA oligo;2)使用BamH I和EcoR I限制性內切酶對慢病毒質粒pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO載體進行雙酶切后,與制備的雙鏈DNA oligo連接,構成重組質粒,轉化感受態(tài)細胞,對生成的陽性克隆進行測序驗證;3)用pSPAX2、pMD2G和穿梭質粒三質粒系統(tǒng)共轉染293T細胞,收集細胞上清液濃縮并測定病毒滴度;4)用構建的Beclin1-shRNA慢病毒感染鼻咽癌CNE2-SC,通過RT-qPCR進行內源性靶篩。3.細胞自噬在鼻咽癌干樣細胞中的功能:1)通過軟瓊脂克隆形成實驗檢測沉默Beclin1表達對鼻咽癌干樣細胞克隆形成的生物學特性的影響;2)再通過RT-qPCR、Western blot實驗檢測沉默Beclin1后干細胞基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)的表達差異;3)流式細胞術檢測分析干細胞標志物CD133的表達情況。結果:1.鼻咽癌CNE2干樣細胞可通過無血清懸浮培養(yǎng)法富集,15天后其能穩(wěn)定傳代。1)將CNE2-SC重置于含10%的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),其能分化為與CNE2細胞相同特性的貼壁細胞;軟瓊脂克隆形成實驗結果表明:CNE2-SC較CNE2的克隆形成率為25±4%vs 8±3%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);2)鼻咽癌CNE2-SC(9.6%)CD133陽性標記的細胞比列高于鼻咽癌CNE2細胞(0.3%)(P0.01);3)與鼻咽癌CNE2細胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表達干性相關基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)(P0.01);4)透射電鏡觀察鼻咽癌CNE2-SC自噬小體較鼻咽癌CNE2細胞形成明顯增多;5)與鼻咽癌CNE2細胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表達自噬相關基因和蛋白(Beclin1、LC3B)(P0.01)。2.Beclin1-RNAi慢病毒載體的構建與鑒定:1)經過PCR和測序驗證成功構建了重組Beclin1-RNAi慢病毒質粒,并將構建好的shBeclin1序列成功插入載體;2)靶序列1-3及對照序列病毒滴度測定結果分別為3.5×10~8TU/ml、3×10~8TU/ml、2×10~9TU/ml和2×10~9TU/ml;3)Real-time PCR內源性篩靶確定在鼻咽癌CNE2-SC中LV-Beclin1-shRNA1慢病毒對Beclin1基因表達的沉默抑制率最高。3.細胞自噬在鼻咽癌CNE2-SC中的功能:1)構建的shBeclin1慢病毒載體可以有效抑制自噬關鍵基因Beclin1的表達水平;2)shBeclin1可以抑制鼻咽癌CNE2-SC的克隆形成;3)shBeclin1可以下調Bmi-1、Twist1等干細胞相關基因及蛋白的表達水平;4)shBeclin1可使干樣細胞標志物CD133表達降低。結論:1.無血清懸浮培養(yǎng)法能富集鼻咽癌干樣細胞;2.鼻咽癌CNE2干樣細胞具有干細胞特性及較高水平自噬表達;3.細胞自噬在鼻咽癌干樣細胞球中持續(xù)激活并以維持鼻咽癌干樣細胞干性。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.63
【圖文】：

圖 1 無血清培養(yǎng)法富集鼻咽癌干樣細胞生長情況(×100)Figure 1 The serum-free culture method enriches the growth of stem-like cells innasopharyngeal carcinoma (×100)注：A 為鼻咽癌 CNE2 細胞，細胞貼壁生長，形態(tài)呈橢圓形或不規(guī)則形，排列緊密；B 為 CNE2 干樣細胞成球懸浮培養(yǎng)第 5天，少數(shù)球體開始成形；C 為 CNE2 干樣細胞培養(yǎng)第 10 天，可見較大的圓形或卵圓形細胞微球體；D 為 CNE2 干樣細胞培養(yǎng)第 15 天，形成由大量細胞緊密結合而成的實體結構。3.2 鼻咽癌干樣細胞干細胞特性鑒定3.2.1 細胞分化實驗我們對鼻咽癌 CNE2-SC 進行分化潛能的實驗檢測，將 CNE2-SC 從無血清培養(yǎng)基中轉移到 6 孔板中培養(yǎng)，6 孔板內是含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，結果如圖 2所示：24 小時后，觀察到 CNE2-SC 球體面積減少，單細胞逐漸增多，在第 7 天，懸浮細胞完全消失，在顯微鏡下觀察均為單細胞，并且大多數(shù)是貼壁生長。形態(tài)與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鼻咽癌 CNE2 細胞無顯著差異。

圖 2 顯微鏡觀察鼻咽癌 CNE2 干樣細胞球分化改變(×100)Figure 2 Phase contrast microscopy observation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 stem-likecell differentiation (×100)注：圖中 A 為分化前，細胞呈球形，懸浮生長，細胞間連接緊密；B 為分化后，細胞貼壁生長，呈橢圓形，排列緊密。3.2.2 軟瓊脂克隆形成克隆形成能力是鼻咽癌干樣細胞重要的生物學特性，通過軟瓊脂克隆形成實驗檢測鼻咽癌 CNE2-SC 及 CNE2 細胞的自我更新能力，將鼻咽癌 CNE2 及 CNE2-SC 分別消化為單細胞懸液，并將各組細胞鋪在加有軟瓊脂的 6 孔板中培養(yǎng) 2 周，然后拍照計數(shù)進行統(tǒng)計分析，結果說明（圖 3）：CNE2-SC 的克隆球形成率（25±4%）明顯高于CNE2（8±3%）（P＜0.05）。

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本文編號：2722578