【摘要】：目的:研究細(xì)胞自噬在維持鼻咽癌CNE2干樣細(xì)胞干細(xì)胞生物特性中的功能,為進(jìn)一步闡明細(xì)胞自噬在調(diào)控鼻咽癌發(fā)病中的作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.無血清懸浮培養(yǎng)法從鼻咽癌CNE2細(xì)胞系中誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2干樣細(xì)胞(CNE2-SC):1)通過細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌CNE2細(xì)胞與CNE2-SC分化能力;軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CNE2細(xì)胞和CNE2-SC克隆形成能力;2)采用流式細(xì)胞儀檢測鼻咽癌CNE2細(xì)胞與CNE2-SC的CD133陽性標(biāo)記細(xì)胞比率;3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot(WB)檢測分析鼻咽癌CNE2細(xì)胞與CNE2-SC的干性相關(guān)基因及蛋白(Bmi-1,Twist1)表達(dá)水平;4)透射電鏡實(shí)驗(yàn)觀察鼻咽癌CNE2細(xì)胞與CNE2-SC自噬小體的形成情況;5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測分析鼻咽癌CNE2細(xì)胞與CNE2-SC的自噬相關(guān)基因及蛋白(Beclin1,LC3B)表達(dá)水平;2.Beclin1-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定:1)設(shè)計(jì)針對(duì)Human Beclin1基因的siRNA靶標(biāo)的三個(gè)靶序列和一個(gè)對(duì)照序列,合成單鏈DNA oligo片段后,將單鏈DNA oligo的正義鏈和反義鏈混合物制備成雙鏈DNA oligo;2)使用BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶對(duì)慢病毒質(zhì)粒pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO載體進(jìn)行雙酶切后,與制備的雙鏈DNA oligo連接,構(gòu)成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)生成的陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證;3)用pSPAX2、pMD2G和穿梭質(zhì)粒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集細(xì)胞上清液濃縮并測定病毒滴度;4)用構(gòu)建的Beclin1-shRNA慢病毒感染鼻咽癌CNE2-SC,通過RT-qPCR進(jìn)行內(nèi)源性靶篩。3.細(xì)胞自噬在鼻咽癌干樣細(xì)胞中的功能:1)通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測沉默Beclin1表達(dá)對(duì)鼻咽癌干樣細(xì)胞克隆形成的生物學(xué)特性的影響;2)再通過RT-qPCR、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測沉默Beclin1后干細(xì)胞基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)的表達(dá)差異;3)流式細(xì)胞術(shù)檢測分析干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)情況。結(jié)果:1.鼻咽癌CNE2干樣細(xì)胞可通過無血清懸浮培養(yǎng)法富集,15天后其能穩(wěn)定傳代。1)將CNE2-SC重置于含10%的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),其能分化為與CNE2細(xì)胞相同特性的貼壁細(xì)胞;軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CNE2-SC較CNE2的克隆形成率為25±4%vs 8±3%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2)鼻咽癌CNE2-SC(9.6%)CD133陽性標(biāo)記的細(xì)胞比列高于鼻咽癌CNE2細(xì)胞(0.3%)(P0.01);3)與鼻咽癌CNE2細(xì)胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表達(dá)干性相關(guān)基因和蛋白(Bmi-1、Twist1)(P0.01);4)透射電鏡觀察鼻咽癌CNE2-SC自噬小體較鼻咽癌CNE2細(xì)胞形成明顯增多;5)與鼻咽癌CNE2細(xì)胞相比,鼻咽癌CNE2-SC高表達(dá)自噬相關(guān)基因和蛋白(Beclin1、LC3B)(P0.01)。2.Beclin1-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定:1)經(jīng)過PCR和測序驗(yàn)證成功構(gòu)建了重組Beclin1-RNAi慢病毒質(zhì)粒,并將構(gòu)建好的shBeclin1序列成功插入載體;2)靶序列1-3及對(duì)照序列病毒滴度測定結(jié)果分別為3.5×10~8TU/ml、3×10~8TU/ml、2×10~9TU/ml和2×10~9TU/ml;3)Real-time PCR內(nèi)源性篩靶確定在鼻咽癌CNE2-SC中LV-Beclin1-shRNA1慢病毒對(duì)Beclin1基因表達(dá)的沉默抑制率最高。3.細(xì)胞自噬在鼻咽癌CNE2-SC中的功能:1)構(gòu)建的shBeclin1慢病毒載體可以有效抑制自噬關(guān)鍵基因Beclin1的表達(dá)水平;2)shBeclin1可以抑制鼻咽癌CNE2-SC的克隆形成;3)shBeclin1可以下調(diào)Bmi-1、Twist1等干細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)水平;4)shBeclin1可使干樣細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)降低。結(jié)論:1.無血清懸浮培養(yǎng)法能富集鼻咽癌干樣細(xì)胞;2.鼻咽癌CNE2干樣細(xì)胞具有干細(xì)胞特性及較高水平自噬表達(dá);3.細(xì)胞自噬在鼻咽癌干樣細(xì)胞球中持續(xù)激活并以維持鼻咽癌干樣細(xì)胞干性。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.63
【圖文】：

圖 1 無血清培養(yǎng)法富集鼻咽癌干樣細(xì)胞生長情況(×100)Figure 1 The serum-free culture method enriches the growth of stem-like cells innasopharyngeal carcinoma (×100)注：A 為鼻咽癌 CNE2 細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)呈橢圓形或不規(guī)則形，排列緊密；B 為 CNE2 干樣細(xì)胞成球懸浮培養(yǎng)第 5天，少數(shù)球體開始成形；C 為 CNE2 干樣細(xì)胞培養(yǎng)第 10 天，可見較大的圓形或卵圓形細(xì)胞微球體；D 為 CNE2 干樣細(xì)胞培養(yǎng)第 15 天，形成由大量細(xì)胞緊密結(jié)合而成的實(shí)體結(jié)構(gòu)。3.2 鼻咽癌干樣細(xì)胞干細(xì)胞特性鑒定3.2.1 細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)我們對(duì)鼻咽癌 CNE2-SC 進(jìn)行分化潛能的實(shí)驗(yàn)檢測，將 CNE2-SC 從無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到 6 孔板中培養(yǎng)，6 孔板內(nèi)是含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，結(jié)果如圖 2所示：24 小時(shí)后，觀察到 CNE2-SC 球體面積減少，單細(xì)胞逐漸增多，在第 7 天，懸浮細(xì)胞完全消失，在顯微鏡下觀察均為單細(xì)胞，并且大多數(shù)是貼壁生長。形態(tài)與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鼻咽癌 CNE2 細(xì)胞無顯著差異。

圖 2 顯微鏡觀察鼻咽癌 CNE2 干樣細(xì)胞球分化改變(×100)Figure 2 Phase contrast microscopy observation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 stem-likecell differentiation (×100)注：圖中 A 為分化前，細(xì)胞呈球形，懸浮生長，細(xì)胞間連接緊密；B 為分化后，細(xì)胞貼壁生長，呈橢圓形，排列緊密。3.2.2 軟瓊脂克隆形成克隆形成能力是鼻咽癌干樣細(xì)胞重要的生物學(xué)特性，通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌 CNE2-SC 及 CNE2 細(xì)胞的自我更新能力，將鼻咽癌 CNE2 及 CNE2-SC 分別消化為單細(xì)胞懸液，并將各組細(xì)胞鋪在加有軟瓊脂的 6 孔板中培養(yǎng) 2 周，然后拍照計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果說明（圖 3）：CNE2-SC 的克隆球形成率（25±4%）明顯高于CNE2（8±3%）（P＜0.05）。

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本文編號(hào)：2722578