發(fā)布時間：2020-06-13 13:13

【摘要】：目的:采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代人Tenon's囊成纖維細胞(Human Tenon's Fibroblasts,HTFs),用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factors-β1,TGF-β1)誘導細胞,建立HTFs活化的模型,進而研究Rho蛋白激酶(Rho Kinase,ROCK)抑制劑K-115對HTFs活化的調(diào)控作用,并探討其相關(guān)機制。為K-115抑制青光眼濾過性手術(shù)(Glaucoma Filtering Surgery,GFS)后瘢痕形成提供細胞水平上的理論支持。方法:1在術(shù)中取青光眼患者的Tenon's囊組織,采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代HTFs。2建立TGF-β1誘導HTFs活化的細胞模型。用CCK-8法檢測TGF-β1最適的作用濃度和時間。3研究K-115對HTFs活化的影響,用不同濃度的K-115預(yù)處理HTFs2小時,然后再用最適濃度的TGF-β1來誘導HTFs;CCK-8法測定K-115預(yù)處理對TGF-β1誘導HTFs活化后的增殖能力的影響,確定K-115作用的最適濃度;Transwell法研究K-115預(yù)處理對TGF-β1誘導HTFs活化后的遷移能力的影響;免疫熒光法檢測K-115預(yù)處理對TGF-β1誘導HTFs活化后細胞內(nèi)ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑSmooth Muscleactin,α-SMA)表達的影響。4研究K-115調(diào)控HTFs活化的作用機制,通過Cyto-ID染色法、流式細胞術(shù)來研究不同濃度K-115預(yù)處理對TGF-β1誘導HTFs活化后細胞的自噬水平、凋亡水平的影響;進一步通過qRT-PCR法、Western blot法檢測不同濃度K-115預(yù)處理對TGF-β1誘導HTFs活化后細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3表達量的影響。結(jié)果:1采用組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了人Tenon's囊成纖維細胞。2建立了TGF-β1誘導HTFs活化的細胞模型。CCK8法結(jié)果表明TGF-β1的最適作用濃度為5ng/ml。24h是觀察TGF-β1促進增殖作用的最適時間。3 CCK8法證實添加K-115組的細胞增殖能力較單純TGF-β1組明顯降低,K-115的最適作用濃度為10umol/L;Transwell遷移實驗表明K-115可以抑制TGF-β1誘導細胞活化后的細胞遷移能力。細胞免疫熒光法證實TGF-β1誘導HTFs后細胞內(nèi)ɑ-SMA的表達量明顯增加,而經(jīng)K-115預(yù)處理后細胞胞質(zhì)中絲狀熒光物質(zhì)陽性表達較單純TGF-β1誘導組明顯減少;4 Cyto-ID染色法結(jié)果表明TGF-β1誘導HTFs活化后細胞的自噬水平上升,而經(jīng)不同濃度(5umol/L、10umol/L)K-115預(yù)處理可以降低細胞活化后的自噬水平,且呈濃度依賴性;流式細胞術(shù)對細胞凋亡的檢測結(jié)果表明K-115預(yù)處理對細胞的凋亡水平無明顯影響。qRT-PCR法、Western blot結(jié)果提示不同濃度K-115預(yù)處理可以抑制TGF-β1誘導的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC-3的上調(diào),且呈濃度依賴性。結(jié)論:ROCK抑制劑K-115對體外培養(yǎng)HTFs沒有明顯的毒性作用,可在一定程度上抑制TGF-β1對人Tenon's囊成纖維細胞的活化作用,其機制可能是調(diào)控了TGF-β1誘導的HTFs的自噬功能。
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R775

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本文編號：2711231