發(fā)布時間：2020-06-11 01:27

【摘要】：目的:本研究目的在于檢測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣病人血漿外泌體中mi RNA-33b-3p表達情況,探究外泌體mi RNA-33b-3p/AXL在其影響肺腺癌細胞增殖以及遷移能力中的作用。方法:(1)收集OSA病人以及健康體檢者外周血,從中分離外泌體,以Western blot檢測其特殊外泌體蛋白Hsp70、CD63、CD9的表達,再通過Nanosight納米顆粒分析技術和透射電鏡鑒定其形態(tài),同時進一步使用q PCR檢測兩組外泌體mi RNA-33b-3p的表達差異。(2)通過PKH26標記外泌體與肺腺癌細胞A549細胞系共同孵育鑒定外泌體可被A549細胞攝入發(fā)揮功能。同時用熒光標記mi RNA-33b-3p轉(zhuǎn)染A549細胞,取其包含特殊mi RNA的外泌體與普通A549細胞共同孵育。(3)將OSA病人組與健康人組外泌體分別孵育A549細胞,對比檢測其對應的mi RNA-33b-3p水平與細胞增殖、遷移能力。(4)為驗證mi RNA-33b-3p在影響A549細胞惡性進展的作用,以mi RNA-33b-3p模擬物轉(zhuǎn)染A549細胞,對比對照組檢測其增殖、遷移能力。(5)為驗證AXL為mi RNA-33b-3p作用蛋白并在mi RNA-33b-3p引起A549細胞惡性增加中的作用,行熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測以及細胞實驗。同時在A549細胞中轉(zhuǎn)染mi RNA-33b-3p抑制劑減弱其調(diào)節(jié)功能的同時,干擾AXL蛋白的表達,探究不同情況下靶細胞增殖和遷移能力以此進一步驗證AXL在mi RNA-33b-3p影響A549細胞惡性進展通路中的作用。結(jié)果:(1)從OSA病人及健康體檢者外周血漿分離外泌體,可見其直徑集中在130nm左右,WB檢測兩組均可見CD63、CD9、Hsp70表達。q PCR檢測OSA病人表達mi RNA-33b-3p較健康體檢組少。(2)外泌體mi RNA可隨外泌體一起被A549細胞攝入。(3)OSA病人外周血外泌體較健康體檢者可促進其共同孵育靶細胞的增殖能力及遷移能力。(4)mi RNA-33b-3p可減弱A549細胞的增殖和遷移能力。(5)AXL蛋白是miRNA-33b-3p減弱A549細胞惡性進展的直接作用蛋白。結(jié)論:OSA病人外周血外泌體mi RNA-33b-3p相對于健康人表達減少,外泌體-mi RNA-33b-3p/AXL通路是OSA病人促進肺腺癌細胞增殖以及遷移增加的機制之一。
【圖文】：

圖 1 A：外泌體電鏡下形態(tài)；B：OSA 病人與健康體顆粒跟蹤分析結(jié)果；C：OSA 組與正常組外泌體蛋白D：正常組與 OSA 組外泌體 miRNA-33b-3p 表達差3.2 外泌體及其內(nèi)容 miRNA-33b-3p 可以由外泌體可在細胞分泌后隨血液流遍全身各處，為攝取，研究中將 PKH26 與外泌體共同孵育，并將此育，共聚焦顯微鏡下可見 A549 細胞含有特殊紅色熒胞攝入了較多外泌體。miRNA 是一種容易被環(huán)境降泌體中，可以對其有一定的保護作用。為進一步驗證泌體一起進入靶細胞，我們將熒光標記的 miR-33b 轉(zhuǎn)生的外泌體，再與普通 A549 細胞共同孵育，在共A549 細胞，可見其內(nèi)有紅色熒光（圖 2B），，表明 m

圖 2 A:與特殊外泌體共同孵育后共聚焦圖像；B：A549 與含紅色熒光標記miR-33b 外泌體共聚焦顯微鏡圖像3.3 OSA 病人外周血外泌體可促進 A549 細胞的增殖能力及遷移能力將 OSA 病人外周血外泌體與 A549 細胞共同孵育，然后通過 CCK8 實驗Transwell 實驗可知，相對于健康對照組外泌體，其可顯著促進 A549 細胞的增殖能力和遷移能力。而且可見其中 OSA 外泌體孵育組細胞中 miRNA-33b 表達量小于健康對照組。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R766;R734.2

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本文編號：2707173