【摘要】：目的:探討角膜移植免疫排斥過程中有氧糖酵解活性的改變,并進(jìn)一步評(píng)估有氧糖酵解途徑對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響。方法:(1)隨機(jī)選取同等數(shù)量的三組健康小鼠,建立正常組、同系穿透性角膜移植組、異系穿透性角膜移植組。通過裂隙燈觀察小鼠角膜透明度及角膜植片免疫排斥情況,各組小鼠均于角膜移植術(shù)后18天左右處死取材,顯微鏡下分離角膜組織,通過Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)檢測各組角膜中有氧糖酵解相關(guān)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glucose transporter 1,GLUT1)、6-磷酸果糖-2-激酶(Fructose-2,6-bisphosphatase-3,PFKFB3)、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDHA)等表達(dá)水平的變化;利用乳酸檢測試劑盒分析各組角膜中有氧糖酵解終產(chǎn)物乳酸的含量;免疫熒光染色分析有氧糖酵解關(guān)鍵蛋白LDHA以及調(diào)控有氧糖酵解關(guān)鍵途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-Myc在角膜植片中的表達(dá)與分布。(2)隨機(jī)選取同等數(shù)量的三組健康小鼠,建立同系穿透性角膜移植組、異系穿透性角膜移植組、異系穿透性角膜移植聯(lián)合藥物處理組即雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)點(diǎn)眼組。通過裂隙燈觀察RAPA對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的影響并記錄角膜植片生存時(shí)間;在角膜移植術(shù)后18天左右處死取材,分離角膜并利用Western Blot分析RAPA對(duì)mTOR通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-Myc以及有氧糖酵解通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響;通過RT-PCR分析各組角膜糖酵解相關(guān)基因表達(dá)水平變化。(3)隨機(jī)選取同等數(shù)量的兩組健康小鼠,建立異系穿透性角膜移植組、異系穿透性角膜移植合并藥物治療組即有氧糖酵解通路關(guān)鍵酶抑制劑3-PO(3-pyridinyl-1-4-pyridinyl-2-propen-1-one)結(jié)膜下注射組。在此基礎(chǔ)上,通過臨床裂隙燈檢查角膜植片免疫排斥情況并記錄生存時(shí)間;角膜移植術(shù)后18天左右處死取材,取各組角膜組織進(jìn)行乳酸含量測定;行RT-PCR檢測各組角膜植片中炎性細(xì)胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素17(Interleukin-17,IL-17)以及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)的表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析炎性細(xì)胞因子IL-1β在各組角膜植片中的含量變化;蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)評(píng)估各組角膜植片的病理變化。結(jié)果:(1)Western Blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,異系角膜移植組有氧糖酵解相關(guān)蛋白PFKFB3、LDHA的含量明顯增多;RT-PCR結(jié)果同樣證實(shí):異系角膜移植組有氧糖酵解相關(guān)基因PFKFB3、LDHA、GLUT1的mRNA水平較同系角膜移植組明顯增加;乳酸定量分析結(jié)果表明異系角膜植片中乳酸含量明顯升高。以上結(jié)果提示,角膜移植免疫排斥過程中有氧糖酵解活性顯著增強(qiáng)。免疫熒光染色結(jié)果表明有氧糖酵解關(guān)鍵蛋白LDHA在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中明顯增高,且多數(shù)分布于炎性細(xì)胞中;排斥角膜植片中mTOR通路調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-Myc表達(dá)水平也增高,且同樣主要集中于炎性細(xì)胞中。以上結(jié)果表明角膜移植免疫排斥過程中有氧糖酵解活性明顯增強(qiáng)。。(2)經(jīng)RAPA納米膠束滴眼液治療后,角膜植片存活時(shí)間明顯延長,植片透明度顯著增高,且未見明顯新生血管長入。Western Blot結(jié)果表明,RAPA可有效抑制mTOR通路活性,主要表現(xiàn)為:4E-BP1、S6磷酸化水平明顯降低;mTOR信號(hào)通路調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-Myc表達(dá)水平顯著減少。經(jīng)RAPA納米膠束滴眼液干預(yù)治療后,角膜植片中有氧糖酵解途徑關(guān)鍵蛋白PFKFB3、LDHA以及GLUT1等的表達(dá)水平明顯降低。以上結(jié)果提示mTOR/c-Myc可能參與調(diào)控角膜移植免疫排斥過程中有氧糖酵通路的活性。(3)與對(duì)照組相比,經(jīng)有氧糖酵解關(guān)鍵酶抑制劑3-PO干預(yù)治療后,角膜植片存活時(shí)間明顯延長、角膜植片的透明度顯著正常、新生血管明顯減少。乳酸定量檢測結(jié)果表明,經(jīng)3-PO干預(yù)后,角膜植片中乳酸的含量明顯降低,提示3-PO可有效抑制有氧糖酵解活性。RT-PCR結(jié)果顯示:經(jīng)3-PO治療后,角膜植片中IL-1β、TNF-α以及IL-17A的mRNA水平顯著下降。ELASA結(jié)果表明:經(jīng)3-PO治療后,角膜植片中成熟形式的IL-1β的含量也明顯減少。HE染色結(jié)果顯示注射3-PO組角膜基質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤減少。這些結(jié)果提示抑制有氧糖酵解途徑可有效緩解角膜移植免疫排斥反應(yīng)。結(jié)論:(1)角膜移植免疫排斥過程中有氧糖酵解活性增加。(2)mTOR信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子c-Myc表達(dá)進(jìn)而調(diào)控有氧糖酵解的活性。(3)抑制有氧糖酵解活性可明顯緩解角膜移植免疫排斥反應(yīng)。
【圖文】：

圖 1.角膜移植免疫排斥中有氧糖酵解通路相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)。（A）正常、同系、異系角膜移植小鼠術(shù)后 18 天眼前節(jié)大體相；（B）Western blot 檢測三組小鼠有氧糖酵解相關(guān)蛋白PFKFB3、LDHA 表達(dá)情況；（C）各組小鼠 PFKFB3、LDHA 灰度值的比值情況。28

圖 2.角膜移植免疫排斥中有氧糖酵解通路相關(guān)基因及終產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)。（A）RT-PCR 檢測同系及異系角膜移植組有氧糖酵解相關(guān)蛋白 PFKFB3、LDHA、GLUT1 mRNA 表達(dá)情況；（B）同系及異系角膜移植組有氧糖酵解終產(chǎn)物乳酸含量的變化；（C）免疫熒光染色顯示正常、同系、異系角膜移植角膜免疫細(xì)胞及有氧糖酵解通路蛋白 LDHA 分布情況。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R779.65

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本文編號(hào)：2701976