【摘要】：目的:結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),探討線粒體細(xì)胞色素C(cytochromec,Cyt-C)通路參與間歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)時(shí)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制,及其線粒體分裂蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor 1,Mdivi-1)對(duì)間歇性低氧肺組織細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制,為研究阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)的發(fā)病機(jī)制及尋求新的預(yù)防和治療方法提供新的靶點(diǎn)。方法:選取健康SPF(specefic pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠32只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組,A對(duì)照組、B IH組、C IH+25 mg/kg Mdivi-1組、D IH+50 mg/kg Mdivi-1組;B、C、D組大鼠循環(huán)給予氮?dú)夂蛪嚎s空氣,對(duì)照組為常氧飼養(yǎng)。4周后建立間歇性低氧SD大鼠模型。分別比較各組間大鼠肺組織HE染色病理改變及積分,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR))和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot,WB)檢測(cè)動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)、Cyt-C、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyla spartate specific proteinase-9,Caspase-9)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyla spartate specific proteinase-3Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(b-cell lymphoma-2,Bcl-2)m RNA和蛋白的表達(dá);體外選取WTRL1大鼠肺細(xì)胞,隨機(jī)分為對(duì)照組、IH組、IH+10μM Mdivi-1組、IH+50μM Mdivi-1組和IH+100μM Mdivi-1組。對(duì)照組暴露于正常培養(yǎng)箱中(CO2 5%,O221%),而IH組、IH+10μM Mdivi-1組、IH+50μM Mdivi-1組、IH+100μM Mdivi-1組被置于三氣培養(yǎng)箱,循環(huán)給予氮?dú)�、氧氣、二氧化碳充�?使得箱內(nèi)CO2 5%,O221%,30 min;CO2 5%,O2 8%30 min,持續(xù)培養(yǎng)12h,且Mdivi-1干預(yù)組于造模前給予Mdivi-1預(yù)先處理30分鐘,造模結(jié)束后通過(guò)RT-q PCR及Western Blot檢測(cè)各組WTRL1造模12h的Drp1、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2的m RNA及蛋白表達(dá)。WTRL1大鼠肺細(xì)胞經(jīng)對(duì)數(shù)培養(yǎng)后,被隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、IH 6h組(B組)、IH 12h組(C組)、IH 24h組(D組)、IH 48h組(E組)。對(duì)照組暴露于正常培養(yǎng)箱中(CO2 5%,O2 21%)培養(yǎng)48h,而IH 6h組、IH 12h組、IH 24h組、IH 48h組被置于三氣培養(yǎng)箱,循環(huán)給予氮?dú)�、氧氣、二氧化碳充�?使得箱內(nèi)CO2 5%,O2 21%,30 min;CO2 5%,O2 8%30 min;分別持續(xù)培養(yǎng)6h、12h、24h、48h,造模結(jié)束后通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組間的WTRL1細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:在暴露于間歇性低氧環(huán)境4周后,SD大鼠肺組織間質(zhì)性損害明顯,而加用線粒體分離蛋白抑制劑的SD大鼠的肺組織間質(zhì)損害減輕。在暴露于間歇性低氧環(huán)境后,SD大鼠肺組織中Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平下降,Caspase-3、Caspase-9和Drp1m RNA和蛋白表達(dá)水平升高。加用Mdivi-1干預(yù)后,Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平增加,Caspase-3、Caspase-9和Drp1 m RNA和蛋白表達(dá)水平下降。大鼠WTRL1細(xì)胞凋亡率隨暴露于IH時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,48h時(shí)凋亡率最高(P0.05)。在間歇性低氧環(huán)境中培養(yǎng)12h后,WTRL1細(xì)胞中的Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平下降,而Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和DRP1 m RNA水平升高。而Mdivi-1干預(yù)后,Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平增加,Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和Drp1 m RNA水平下降(P0.05)。結(jié)論:Mdivi-1對(duì)IH誘導(dǎo)的SD大鼠肺組織細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用,其機(jī)制可能為抑制線粒體/Cyt-C凋亡途徑。
【圖文】：

義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 尹成一2.1 大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)光鏡下大鼠肺組織 HE 染色形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為：對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰、完整，壁薄，泡大小基本一致，肺泡腔內(nèi)無(wú)水腫液，肺間隔見(jiàn)少許的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；IH 組肺泡隔破壞嚴(yán)重，肺泡間隔增厚，間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而 Mdivi-1 干預(yù)組肺組損傷較 IH 組輕，肺泡間隔破壞不明顯，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨 Mdivi-1 給藥度的增加，該變化更加明顯（圖 1）2 結(jié)果

13圖 2 每組肺組織經(jīng) RT-qPCR 檢測(cè) Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C 和 Drp1mRNA 的表達(dá)水平。 (A) Bcl-2、(B) Caspase-3、 (C) Caspase-9、 (D) Drp-1、(E) Cyt-C ；同對(duì)照組相比，，IH 組 Caspase-3 和 Caspase-9 mRNA水平明顯增高，Bcl-2 水平明顯下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同低氧組相比，IH+50 mg/kgMdivi-1 組大鼠的 Bcl--2 mRNA 水平升高，而 Caspase-3 和 Drp1 mRNA 水平下降(P<0.05)。*與對(duì)照組比較，P＜0.05,#與 IH 組比較，P＜0.05，Group C：對(duì)照組。2.3 各組間 Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C 和 Drp1 蛋白表達(dá)比
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R766

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本文編號(hào)：2701302