本文關鍵詞：慢病毒ShRNA干擾PGC-1α表達在DR中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究通過檢測在AGEs環(huán)境中人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926、RPE細胞株ARPE-19以及DM大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α、VEGF、及EGR-1的表達變化,探究PGC-1α在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展中的作用,及PGC-1α、VEGF與EGR-1間的關系,為DR的發(fā)生發(fā)展及治療提供一定理論依據(jù)。方法確定PGC-1αsi-RNA序列:sense,5’-AAGACGGAUUGCCCUCAUUUGtt-3’;antisense,5’-CAAAUGAGGGCAAUCCGUCUUtt-3’。合成含PGC-1α序列的單鏈DNA,然后退火配對產(chǎn)生雙鏈,再通過其兩端所含酶切位點直接連入酶切后的RNAi慢病毒載體上;將連接產(chǎn)物轉入制備好的細菌感受態(tài)細胞,PCR鑒定陽性重組子后,送測序驗證,測序結果經(jīng)比對確認正確的克隆即為構建成功PGC-1αRNAi慢病毒載體。取生長狀態(tài)良好的內皮細胞與RPE細胞,經(jīng)AGEs(1g/L)干預4d后,加入慢病毒包裝的PGC-1αSh RNA感染后,分普通培養(yǎng)液培養(yǎng)及AGEs持續(xù)培養(yǎng),具體實驗分組如下:A.普通培養(yǎng)液培養(yǎng);B.AGEs培養(yǎng)(1g/L);C.AGEs培養(yǎng)4天后PGC-1αRNA干擾1.繼而更換正常培養(yǎng)液培養(yǎng);2.持續(xù)AGEs(1g/L)培養(yǎng)。檢測慢病毒對內皮細胞、RPE細胞的感染率。采用免疫細胞化學檢測各組細胞PGC-1α、VEGF及EGR-1的表達情況。提取細胞總RNA,應用RT-PCR檢測PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,進行數(shù)據(jù)歸納和統(tǒng)計學分析。SD大鼠腹腔注射STZ制作糖尿病模型。對DM大鼠行玻璃體腔注射慢病毒包裝的PGC-1αsh RNA,具體實驗分組:A.正常組(10只)B.糖尿病組(1.糖尿病4W組(10只)2.糖尿病8W組(10只))C.RNAi組(1.DM 4周玻璃體腔注射PGC-1α干擾RNA10天后取材(10只)2.DM 8周玻璃體腔注射PGC-1α干擾RNA10天后取材(10只))。觀察大鼠玻璃體腔轉染情況:玻璃體腔注射一周后,行眼球冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察sh RNA慢病毒對視網(wǎng)膜轉染情況。采用免疫組織化學檢測各組大鼠視網(wǎng)膜PGC-1α、VEGF及EGR-1的表達情況。提取大鼠視網(wǎng)膜總RNA,應用RT-PCR檢測PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,進行數(shù)據(jù)歸納和統(tǒng)計學分析。結果陽性重組子測序結果序列比對完全正確,表明靶向PGC-1α的RNA干擾慢病毒制備成功。靶向PGC-1α的慢病毒Sh RNA轉染293T細胞2天后,在熒光顯微鏡下觀察同一視野的熒光和可見光照片,可見慢病毒轉染率高達95%以上。在MOI=100 polybreen(+)時內皮細胞和RPE細胞感染效果好,感染率達80%—85%。免疫細胞化學與實時熒光PCR檢測結果顯示在正常內皮細胞與RPE細胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表達,內皮細胞與RPE細胞在AGEs培養(yǎng)后PGC-1α、VEGF與EGR-1在蛋白及m RNA水平升高,組間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);在使用慢病毒Sh RNA干擾PGC-1α后更換普通培養(yǎng)液培養(yǎng),PGC-1α、VEGF與EGR-1均較AGEs培養(yǎng)后下降(p0.05);繼續(xù)使用AGEs培養(yǎng),PGC-1α、VEGF與EGR-1表達雖比AGEs培養(yǎng)組下調(p0.05),但仍較更換普通培養(yǎng)液組升高(p0.05)。玻璃體腔注射后視網(wǎng)膜轉染率高,熒光顯微鏡下觀察顯示高熒光。免疫組織化學與實時熒光PCR檢測結果顯示糖尿病組PGC-1α、VEGF與EGR-1較正常組在蛋白及m RNA水平升高,組間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),且PGC-1α和VEGF的表達均隨病程進展而表達增加。RNAi組PGC-1α蛋白及m RNA水平均較糖尿病組下降(p0.05),VEGF與EGR-1在玻璃體腔注射慢病毒Sh RNA干擾PGC-1α后較同病齡糖尿病組未見明顯改變。結論1.在正常內皮細胞與RPE細胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表達,AGEs環(huán)境下內皮細胞與RPE細胞中PGC-1α、EGR-1及VEGF表達均明顯升高。2.使用PGC-1αSh-RNA慢病毒轉染經(jīng)干預AGEs過的細胞后,細胞中PGC-1α在蛋白與m RNA水平表達均下調至正常水平,同時EGR-1和VEGF在蛋白與m RNA水平表達也下調至正常水平。可見PGC-1α與EGR-1、VEGF在內皮細胞與RPE細胞中表達存在正相關。3.即使經(jīng)PGC-1αSh-RNA慢病毒干擾,但若內皮細胞與RPE細胞仍持續(xù)處于AGEs環(huán)境中,PGC-1α、VEGF與EGR-1表達雖較AGEs培養(yǎng)組下調,但仍無法回歸到正常水平,推斷因AGEs的堆積造成“代謝記憶”。4.在DM大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α、EGR-1及VEGF表達均明顯上調,且PGC-1α與VEGF的表達隨DM病程進展而增加。5.在對DM大鼠進行RNA干擾后,大鼠視網(wǎng)膜中PGC-1α較同病齡的DM大鼠下調,但EGR-1和VEGF與同病齡的DM大鼠比較無明顯變化。推測因體內環(huán)境復雜,DM發(fā)生后在多信號通路啟動及“代謝記憶”產(chǎn)生的情況下,EGR-1及VEGF表達無法回到正常水平。
【關鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 PGC-1α RNA干擾 VEGF EGR-1
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 英文縮略一覽表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一部分 PGC-1α ShRNA慢病毒表達載體的構建與鑒定11-15
• 前言11-12
• 材料及方法12-14
• 結果14-15
• 第二部分 慢病毒ShRNA干擾PGC-1α 在內皮細胞與RPE細胞中的表達15-35
• 前言15-17
• 材料及方法17-25
• 結果25-35
• 第三部分 慢病毒ShRNA干擾PGC-1α 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達35-47
• 前言35-36
• 材料與方法36-40
• 結果40-47
• 討論47-53
• 結論53-55
• 參考文獻55-59
• 綜述59-68
• 參考文獻64-68
• 致謝68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 梁璇;丁新民;霍艷英;潘興斌;隋建麗;白貝;徐勤枝;周平坤;;ERK1/2-Sp1信號通路對肺癌細胞VEGF的調控作用[J];癌變.畸變.突變;2007年04期

2 陳淑娟;汪新宇;羅國春;薛耀明;;PGC-1α對高糖誘導的血管內皮細胞內ROS生成的影響[J];山東醫(yī)藥;2010年21期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 謝茂松;炎癥因子在前節(jié)內眼手術誘發(fā)血視網(wǎng)膜屏障破壞中的作用及機制研究[D];山東大學;2008年

  本文關鍵詞：慢病毒ShRNA干擾PGC-1α表達在DR中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270169