【摘要】：研究背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是發(fā)生于鼻咽黏膜的上皮性惡性腫瘤。鼻咽癌在大部分發(fā)達國家地區(qū)很罕見,發(fā)病率低于1/10萬(人/年),而在我國華南地區(qū)及東南亞地區(qū),其發(fā)病率高至10-25/10萬(人/年)。鼻咽癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素相互作用的過程,其病因主要包括遺傳易感性、EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染和環(huán)境致癌。目前鼻咽癌的主要治療手段是以放射治療為主的綜合治療。隨著治療手段的不斷優(yōu)化,鼻咽癌患者的總五年生存率已達到80%以上,但仍有部分患者出現(xiàn)腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移而治療失敗。因此,探索鼻咽癌的發(fā)病機制,尋找新的治療靶點和手段具有重要意義。能量代謝異常是腫瘤的十大標志性特征之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,其能量代謝發(fā)生了顯著改變,包括糖代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等代謝模式的改變,其中以糖代謝異常的報道居多。除了糖代謝異常,脂肪酸代謝異常也日益成為腫瘤代謝研究的熱點。酮體是脂肪酸代謝的下游產(chǎn)物之一,其對腫瘤的惡性生物學(xué)行為影響目前還尚不明確。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),生酮路徑關(guān)鍵基因羥甲基戊二酰輔酶A裂解酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,HMGCL)在鼻咽癌中表達下調(diào),提示鼻咽癌中存在著酮體代謝異常。β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate,β-HB)是酮體的主要成分之一,具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑的活性,可通過調(diào)控組蛋白乙�；揎椝接绊懟蚪M的轉(zhuǎn)錄水平,已被發(fā)現(xiàn)參與一些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。目前,β-羥丁酸代謝異常對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展的影響及其具體機制尚未明確。我們前期研究證實,在鼻咽癌細胞中過表達HMGCL基因可增加鼻咽癌細胞內(nèi)β-羥丁酸含量,從而通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用抑制細胞遷移和侵襲的能力。我們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)、外源性β-羥丁酸均能顯著增加鼻咽癌細胞CDH1基因編碼的上皮性鈣黏蛋白E-cadherin的表達水平。作為鈣粘蛋白家族成員,E-cadherin對維持上皮細胞的極性和細胞間的黏連性起著關(guān)鍵的作用,其表達下調(diào)也是腫瘤EMT的重要分子標志物,預(yù)示腫瘤的惡性進展。CDH1基因是調(diào)控鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子之一,鼻咽癌中CDH1的表達失活可由于mi RNA靶向調(diào)控、啟動子高甲基化修飾等機制調(diào)控。而β-羥丁酸調(diào)控鼻咽癌CDH1基因的轉(zhuǎn)錄和表達的機制仍不清楚。研究目的:以CDH1基因為例,探究β-羥丁酸通過影響組蛋白乙�；綄Ρ茄拾┘毎碛^基因組的調(diào)控及其分子機制。研究細胞代謝對鼻咽癌表觀遺傳學(xué)的影響,探討鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。研究方法:1.利用熒光法檢測β-羥丁酸對鼻咽癌組蛋白去乙�；�(histone deacetylases,HDACs)活性的影響。2.利用Western blot方法檢測β-羥丁酸對鼻咽癌組蛋白乙�；挠绊憽�3.分別通過熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和Western blot實驗檢測β-羥丁酸對鼻咽癌細中CDH1基因轉(zhuǎn)錄和表達水平的影響。4.利用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測方法(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)檢測β-羥丁酸對鼻咽癌細胞中CDH1啟動子區(qū)域組蛋白乙酰化水平的影響。5.聯(lián)合染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測序(chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IP-seq)和RNA轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-seq)描繪β-羥丁酸對鼻咽癌細胞表觀基因組的影響。研究結(jié)果:1.β-羥丁酸抑制鼻咽癌細胞中組蛋白去乙�；傅幕钚浴＝�(jīng)β-羥丁酸處理的鼻咽癌細胞5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV組蛋白去乙酰化酶活性顯著降低,其抑制的倍數(shù)分別為1.470(P=0.000)、1.091(P=0.002)、1.097(P=0.078)、1.400(P=0.000)倍。結(jié)果表明,β-羥丁酸抑制鼻咽癌細胞中的組蛋白去乙�；浮�2.β-羥丁酸上調(diào)鼻咽癌細胞的組蛋白乙�；健＝�(jīng)不同濃度β-羥丁酸處理的鼻咽癌細胞(5-8F、HONE1、CNE2-EBV、HK1-EBV)中乙酰化組蛋白H3(Lys9/Lys14)(Acety-H3(K9/14))、乙酰化賴氨酸(Acety-Lys)相對表達量較未經(jīng)處理的鼻咽癌細胞顯著上調(diào)。其中,按β-羥丁酸濃度梯度的遞增(5,10,20m M),5-8F細胞中Acety-H3(K9/14)上調(diào)的倍數(shù)分別為1.767、1.182、1.342倍,HK1-EBV細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為1.195、1.537、1.866,CNE2-EBV細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為1.372、1.537、1.408倍,說明β-羥丁酸促進鼻咽癌細胞的組蛋白乙�；�。3.β-羥丁酸促進鼻咽癌CDH1的轉(zhuǎn)錄和表達水平。經(jīng)β-羥丁酸處理的鼻咽癌細胞(5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV)中CDH1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),轉(zhuǎn)錄水平隨其濃度梯度的遞增(5,10,20m M),在5-8F細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為1.988、2.207、3.227、5.313倍,HONE1中上調(diào)倍數(shù)分別為1.102、1.412、1.711、1.883倍,HK1-EBV中分別為0.763,1.120,1.384,1.577倍,CNE2-EBV細胞中分別為0.835,0.996,1.286,2.615倍,說明β-羥丁酸可促進鼻咽癌細胞CDH1基因的m RNA的轉(zhuǎn)錄水平。β-羥丁酸處理后5-8F細胞的E-cadherin蛋白的表達水平顯著提高,而HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV細胞處理后的E-cadherin蛋白表達水平無顯著變化。4.β-羥丁酸通過組蛋白乙�；龠M鼻咽癌細胞中CDH1的表達。通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)β-羥丁酸處理的鼻咽癌細胞5-8F、HONE1 Input%高于對照組,升高幅度分別為125.093和1.116倍,P值分別為0.000和0.494,結(jié)果表明β-羥丁酸促進CDH1啟動子區(qū)組蛋白的乙酰化水平,提示β-羥丁酸通過組蛋白的乙�；龠M鼻咽癌細胞中CDH1基因的表達。5.高通量篩選β-羥丁酸通過組蛋白乙�；险{(diào)鼻咽癌細胞中的基因表達譜。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)β-羥丁酸處理前后鼻咽癌細胞5-8F中有1294個差異基因;而通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序,發(fā)現(xiàn)β-羥丁酸處理前后5-8F細胞的組蛋白乙�；揎棽町惖幕蛞还灿�1295個差異基因。綜合分析確定5-8F細胞中β-羥丁酸通過增加組蛋白的乙�；龠M轉(zhuǎn)錄表達的基因共有32個,從而初步建立了鼻咽癌細胞中β-羥丁酸通過組蛋白乙酰化修飾調(diào)控的基因譜。研究結(jié)論:1.β-羥丁酸抑制鼻咽癌細胞組蛋白去乙酰化酶的活性,是組蛋白去乙�；傅囊种苿�2.β-羥丁酸可促進鼻咽癌細胞中組蛋白乙�；健�3.β-羥丁酸可增加鼻咽癌細胞中5-8F、HONE1、HK1-EBV的CDH1的轉(zhuǎn)錄和表達水平。4.β-羥丁酸通過組蛋白的乙酰化促進鼻咽癌細胞中CDH1的表達。5.篩選出32個β-羥丁酸靶向組蛋白的乙�；{(diào)控的基因。綜上,β-羥丁酸抑制鼻咽癌細胞的組蛋白去乙�；富钚�,促進鼻咽癌細胞組蛋白乙酰化水平,并通過促進鼻咽癌細胞CDH1啟動子區(qū)組蛋白的乙�；�,由此上調(diào)CDH1的轉(zhuǎn)錄和表達,此外,還篩選確立了β-羥丁酸靶向組蛋白的乙酰化調(diào)控的基因譜式。
【圖文】：

SS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨立樣本 T Test 分*p<0.05、** p<0.01、***p<0.001 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。果 β-羥丁酸抑制鼻咽癌細胞中組蛋白去乙�；傅幕钚浴榱藱z測β-羥丁酸對鼻咽癌組蛋白去乙�；富钚缘挠绊懀姚�-羥丁酸處理 4 株鼻咽癌細胞（5-8F、HONE1、HK1-EBV 和E2-EBV），用熒光法檢測發(fā)現(xiàn)：全部 4 株鼻咽癌細胞在處理后β-酸組蛋白去乙�；富钚燥@著降低，其抑制的倍數(shù)分別為70(P=0.000)、1.091(P=0.002)、1.097(P=0.078)、1.400(P=0.000)倍。β-羥丁酸可抑制鼻咽癌細胞中組蛋白去乙�；富钚裕哂薪M蛋乙�；敢种谱饔茫▓D 1-1）。

2.2 β-羥丁酸上調(diào)鼻咽癌細胞的組蛋白乙�；健檫M一步驗證β-羥丁酸對鼻咽癌組蛋白乙�；降挠绊懀ㄟ^Western blot 方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度β-羥丁酸處理的鼻咽癌細胞（5-8FHONE1、CNE2-EBV和HK1-EBV）中的乙�；M蛋白H3（Lys9 / Lys1（Acety-H3(K9/14)）相對表達量較未經(jīng)處理的鼻咽癌細胞顯著上調(diào)且上調(diào)水平按β-羥丁酸濃度梯度的遞增（5，，10，20mM），Acety-H3K9/14 在 5-8F 細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為 1.767、1.182、1.34倍，在 HK1-EBV 細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為 1.195、1.537、1.866,在CNE2-EBV 細胞中上調(diào)的倍數(shù)分別為 1.372、1.537、1.408 倍，進一步說明β-羥丁酸上調(diào)鼻咽癌細胞的組蛋白乙�；剑�*p＜0.05, **＜0.01，***p＜0.001，圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.63

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