【摘要】：目的:增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是孔源性視網(wǎng)膜脫離(Rhegmatogenous retinal detachments,RD)術后的嚴重并發(fā)癥,也是造成手術失敗的最主要原因。從其最初被詳細闡述至目前為止,尚無有效的相關臨床治療進展。雖然PVR可以發(fā)生在術前,但其在任何種類的眼內(nèi)RD手術干預后,都具有更高的發(fā)病率,PVR在所有RD術后的發(fā)病率為5-10%。脫離的視網(wǎng)膜及玻璃體后界膜表面的增殖膜為PVR的病理特征,其收縮導致的視網(wǎng)膜扭曲及持續(xù)脫離將孔源性視網(wǎng)膜脫離轉(zhuǎn)變?yōu)闋恳砸暰W(wǎng)膜脫離。在這種病理進程中,視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal pigment epithelium,RPE)通過上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)丟失上皮特征,而獲得間葉細胞表型,增加了細胞的遷徙能力、侵襲性、抵抗凋亡能力、以及細胞外基質(zhì)的生成,使RPE轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維樣細胞�；赑VR的這種最主要的細胞學特征,很多研究者付出了40余年的努力去探索,但仍未找到有效的預防及治療PVR的方法。因此,我們推測,RD及PVR形成過程中有多種分子生物學機制參與其中。自噬是調(diào)節(jié)降解非必需或者功能障礙細胞器或蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)分解代謝過程。通過自噬機制細胞可以消化損傷的蛋白質(zhì)分子或者細胞器,從而確保維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。然而,自噬也被認為是細胞對抗細胞內(nèi)或者環(huán)境壓力的策略,這包括營養(yǎng)剝奪,缺氧及藥物影響。降解細胞器是細胞獲得能量供給及基本代謝物質(zhì)的替代機制。在眼內(nèi),從最前部的角膜到后部的給視網(wǎng)膜提供保護屏障的RPE,幾乎所有的細胞類型都依賴一種或多種類型的自噬去維持正常的結(jié)構(gòu)及生理功能。而且,自噬相關蛋白在眼部不同細胞中的表達也闡明了自噬進程在維持健康視功能中的重要性。相反,相關自噬基因的突變也可直接導致眼部疾病的發(fā)生,同時,眼內(nèi)細胞穩(wěn)態(tài)也依賴于通過基礎與壓力的相互作用誘導的自噬通路進行調(diào)節(jié)。視網(wǎng)膜RPE細胞及光感受器細胞中,自噬是被高度激活的,自噬功能的損害可導致RPE細胞早期退化變性。RPE的這些特征將自噬與視網(wǎng)膜衰老性疾病及光損傷導致的視網(wǎng)膜退行性疾病緊密關聯(lián)。這使得自噬與視網(wǎng)膜疾病的研究熱點集中在例如年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)等退行性病變中。自噬與EMT因為各自相對獨立的作用機制,導致疏遠的關聯(lián)性,而不能被聯(lián)系起來。然而,近來研究揭示,這兩種重要進程可通過復雜的關系相互調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn),在視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,自噬除了可以保護RPE細胞抵御氧化應激等壓力刺激,阻止視網(wǎng)膜退化變性外,自噬也參與了RPE細胞的EMT進程。在TGF-β體外誘導RPE細胞EMT進程中,促進了細胞自噬行為的發(fā)生,但這種非生存壓力導致的細胞自噬行為的作用機制尚不清楚,需要進一步論證,這也是本研究尚需解決的關鍵問題。我們推測自噬通路可能在PVR病理進程中起到重要調(diào)控作用,而這種調(diào)控機制的闡明將為PVR的預防及治療提供新思路。方法:1、構(gòu)建自噬相關基因7(Atg7)缺失的視網(wǎng)膜色素上皮細胞系,應用Western blot檢測細胞中occludin,ZO-1表達的變化,觀察細胞平面及三維空間中生長狀態(tài),檢測α-SMA表達及定位的變化,初步探討自噬與RPE細胞EMT的關系。2、TGF-β誘導RPE細胞EMT模型的建立:體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系ARPE-19,給予不同濃度及時間梯度TGF-β刺激,通過Western blot及細胞免疫熒光實驗分別檢測,上皮表型因子:Claudin-1,間葉樣表型因子:N-cadherin,及細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白、應力纖維蛋白:α-SMA、Vimentin,的表達變化,尋找TGF-β誘導RPE細胞發(fā)生EMT的適合濃度及時間,確定RPE細胞上皮表型及間葉表型特征分子。3、檢測RPE細胞EMT進程中自噬流的變化:不同時間梯度TGF-β刺激條件下,Western blot檢測自噬相關蛋白Atg7表達變化;通過檢測p62及LC3變化探討自噬流及自噬體形成的影響,構(gòu)建GFP-LC3真核表達載體,并外轉(zhuǎn)入ARPE-19,熒光倒置顯微鏡觀察并記錄活體細胞中GFP-LC3點狀聚集情況;應用溶酶體抑制劑CQ阻斷自噬-溶酶體復合物降解,通過Western blot檢測,明確TGF-β在RPE細胞中對自噬流的影響。4、檢測自噬在調(diào)控RPE細胞EMT進程的作用:4.1分別以Serum starvation及Rapamycin為刺激條件,誘導細胞自噬的發(fā)生,檢測自噬相關蛋白Atg7,p62及LC3表達變化,Western blot及細胞免疫熒光實驗檢測上皮表型因子Claudin-1,間葉樣表型因子N-cadherin表達變化,探討其與自噬行為的相關性。4.2體外構(gòu)建Atg7 RNAi及control RNAi干擾載體,經(jīng)質(zhì)粒純化提取,慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞293T,感染RPE細胞,構(gòu)建穩(wěn)定沉默Atg7基因表達的ARPE-19細胞系。從而得到自噬缺陷的RPE細胞,檢測Claudin-1及N-cadherin蛋白的表達;Transwell檢測細胞遷移能力;體外凝膠收縮實驗檢測RPE細胞收縮能力。4.3構(gòu)建Myc-Atg7質(zhì)粒表達載體,分別于野生型ARPE-19細胞系及Atg7shRNA細胞系瞬時轉(zhuǎn)染Atg7,檢測Claudin-1及N-cadherin蛋白的表達。通過挽救實驗進一步明確自噬對RPE細胞EMT的調(diào)控作用。4.4應用TGF-β及自噬誘導劑Rapamycin,Western blot及細胞免疫熒光實驗分別檢測自噬誘導劑Rapamycin對TGF-β引起EMT的挽救作用;Transwell實驗檢測細胞遷移能力的改變;體外凝膠收縮實驗檢測RPE細胞收縮能力的改變。5、探索自噬調(diào)控EMT發(fā)展的分子機制:提取小鼠WT MEF及Atg7~(-/-)MEF細胞,應用免疫共沉淀方法檢測在TGF-β及HBSS饑餓條件刺激下,EMT上游關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist與p62的結(jié)合變化。結(jié)果:1、Atg7缺失導致RPE細胞纖維化發(fā)生。2、成功構(gòu)建RPE上皮細胞層EMT模型,TGF-β刺激條件下,細胞間緊密連接蛋白Claudin-1表達降低,間葉性標志物:N-cadherin、α-SMA、Vimentin表達升高。細胞顯纖維樣改變。3、RPE發(fā)生EMT進程中,細胞自噬被激活,p62表達下降,LC3-II表達升高,細胞內(nèi)GFP-LC3發(fā)生聚集。4、成功構(gòu)建了Atg7的真核表達載體;構(gòu)建了Atg7穩(wěn)定敲減的ARPE-19細胞系,Atg7的敲減效率在70%以上。5、在通過敲減Atg7獲得自噬缺陷的RPE細胞中,Claudin-1表達降低,間葉性標志物:N-cadherin,α-SMA、Vimentin表達升高;細胞遷移能力增強,收縮能力增強。6、給與自噬缺陷的RPE細胞過表達Atg7,Claudin-1的表達增加,而N-cadherin,α-SMA、Vimentin表達降低;給與正常RPE細胞無血清饑餓刺激,也可見細胞上皮特征的增強。7、在正常RPE單細胞層EMT進程中,通過給與Rapamycin促進細胞自噬,可以逆轉(zhuǎn)TGF-β引起的Claudin-1降低,阻止N-cadherin、α-SMA、Vimentin表達升高,降低細胞遷移能力及收縮能力。8、Atg7敲除小鼠MEF細胞中,對比野生型小鼠MEF細胞,p62明顯積累,LC3-II型表達明顯減弱;同時間葉性蛋白表達明顯升高。9、野生型小鼠MEF細胞給與HBSS或無血清饑餓刺激,可見細胞間葉性蛋白標志物的明顯降低。對比Atg7~(-/-)MEF細胞,同時給與無血清饑餓刺激,可見WT MEF細胞間葉性蛋白降低,而自噬功能缺陷細胞無明顯改變。10、免疫共沉淀實驗結(jié)果揭示,在TGF-β作用下,p62與Twist結(jié)合不增加,而在HBSS饑餓條件下與Twist結(jié)合明顯增加。結(jié)論:1、自噬是維持視網(wǎng)膜色素上皮細胞正常上皮形態(tài)的關鍵通路。2、促進自噬可以保護RPE抵抗EMT壓力,維持正常細胞間緊密連接結(jié)構(gòu),逆轉(zhuǎn)細胞纖維化進程,維持RPE細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。3、p62介導的選擇性自噬,通過與Twist結(jié)合,介導Twist的降解,從而抵抗EMT的發(fā)展進程。我們的研究為自噬與視網(wǎng)膜色素上皮細胞纖維化性疾病的關系提供了更完整的理解,為自噬可能成為PVR治療靶點提供了新觀點。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結(jié)果3.1 穩(wěn)定敲減 ATG7 的 ARPE-19 細胞株的構(gòu)建shATG7#1 及 shATG7#2 質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝后，感染 ARPE-19 細胞株，通過Western blotting 檢測 ATG7 蛋白表達量，結(jié)果如圖 1 所示，shATG7#1 組及 shATG7#2組與 shNC 組相比，ATG7 蛋白表達明顯降低。條帶灰度值分析后，分別與 shNC 組相比，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義。

圖 2 穩(wěn)定敲減 ATG7 后 ARPE-19 細胞中 occludin 及 ZO-1 的蛋白表達量A, Western blotting analysis of occludin and ZO-1 in shNC and shATG7 ARPE-19 cells. BQuantification of the band intensities of occludin and ZO-1 obtained by Western blotting analysis asin panel (A), expressed as the means±S.D., **P<0.01 vs shNC.3.3 穩(wěn)定敲減 ATG7 后 ARPE-19 細胞形態(tài)的變化體外分別培養(yǎng) shNC 組，shATG7 組細胞，，待細胞融合后繼續(xù)培養(yǎng) 3 天，觀察細胞形態(tài)。如圖 3 所示，與 shNC 組相比，shATG7#1 與 ATG7#2 細胞明顯失去整齊排列的上皮細胞形態(tài)，成纖維樣改變。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R774.1

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本文編號：2696732