【摘要】：目的葡萄膜炎(uveitis)是眼科最常見的一種自身免疫性疾病。在我國葡萄膜炎的發(fā)病率一直居高不下,并且葡萄膜炎會導(dǎo)致不可逆性的失明,國外有研究表明約有10%的失明是由葡萄膜炎導(dǎo)致,因此葡萄膜炎一直是我國防盲重點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn),IL-23/Th17軸對于葡萄膜炎的致病起著十分重要的作用,其中IL-23是葡萄膜炎發(fā)病關(guān)鍵的細(xì)胞因子,c-Rel/IL-23/IL-17通路與包括葡萄膜炎在內(nèi)的自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)。本研究的目的在于設(shè)計(jì)一種能夠特異性識別轉(zhuǎn)錄因子c-Rel在IL-23p19基因啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)的小分子多肽抑制劑,從而抑制IL-23p19的表達(dá),減少致病性Th17細(xì)胞的數(shù)目以起到預(yù)防葡萄膜炎的目的。這將為包括自身免疫性葡萄膜炎在內(nèi)的自身免疫性疾病的防治提供新的思路。方法1.構(gòu)建包含IL-23p19κ1片段啟動子載體,進(jìn)行雙熒光素酶檢測。研究小分子多肽抑制劑對于IL-23p19啟動子活性的影響。2.誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞,用或不用小分子多肽抑制劑處理。研究小分子多肽抑制劑是否影響IL-23p19的表達(dá)。3.用小分子多肽抑制劑處理或不處理BMDC、BMDM、T細(xì)胞,通過ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-12、IL-6等細(xì)胞因子的濃度。研究小分子多肽抑制劑是否特異性的影響IL-23p19的表達(dá)。4.用小分子多肽抑制劑處理或不處理BMDC、293T等細(xì)胞,通過細(xì)胞活性檢測。研究小分子多肽抑制劑對于細(xì)胞生長是否有毒性。5.用吖啶橙活細(xì)胞染料將小分子多肽抑制劑處理過的細(xì)胞染色,用熒光顯微鏡觀察。研究小分子多肽抑制劑是否能夠進(jìn)入細(xì)胞核。6.構(gòu)建小鼠EAU模型,尾靜脈注射一定濃度的小分子多肽抑制劑或DMSO。通過觀察小鼠眼球病理切片并評分判斷建模是否成功,脾臟、眼球等細(xì)胞經(jīng)過一定的刺激后,收集上清用ELISA檢測炎癥因子IL-17A、IL-23的表達(dá)。研究小分子多肽抑制劑能否預(yù)防自身免疫性葡萄膜炎。結(jié)果1.通過構(gòu)建包含IL-23p19κ1片段啟動子載體,進(jìn)行雙熒光素酶檢測的結(jié)果證明小分子多肽抑制劑在體外能抑制IL-23p19啟動子的活性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P0.01)。2.通過用或不用小分子多肽抑制劑處理BMDC,通過ELISA和Q-PCR檢測,結(jié)果證明小分子多肽抑制劑可以在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平抑制IL-23p19表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**p0.01,***p0.001)。3.通過用或不用小分子多肽抑制劑處理BMDC、BMDM、T細(xì)胞,用ELISA檢測IL-12、IL-6等細(xì)胞因子,結(jié)果顯示各細(xì)胞因子濃度沒有明顯差異(P0.05)。4.通過用小分子多肽抑制劑處理或不處理BMDC、293T等細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。結(jié)果顯示各種細(xì)胞活性沒有明顯差異(P0.05)。5.熒光顯微鏡結(jié)果顯示小分子多肽抑制劑能夠進(jìn)入細(xì)胞核。6.通過構(gòu)建小鼠EAU模型,尾靜脈注射一定濃度的小分子多肽抑制劑或DMSO。結(jié)果顯示,小分子多肽抑制劑組視網(wǎng)膜病理評分低于DMSO組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。小分子多肽抑制劑組脾臟、眼球等細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-17A、IL-23低于DMSO組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,**P0.01)。結(jié)論1.小分子多肽抑制劑顯著抑制IL-23p19表達(dá)。2.小分子多肽抑制劑不影響其它細(xì)胞因子的表達(dá)。3.小分子多肽抑制劑處理對細(xì)胞生長沒有明顯毒性作用。4.小分子多肽抑制劑可以以IL-23p19為靶點(diǎn)來預(yù)防葡萄膜炎。
【圖文】：

圖 1 小分子多肽結(jié)構(gòu).2 小分子多肽顯著抑制 IL-23p19 表達(dá).2.1 小分子多肽處理顯著抑制 IL-23p19 啟動子的活性通過將構(gòu)建的含有 IL-23p19κ1 片段啟動子的載體，用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 Raw264.，并用四種不同條件刺激：100nM 小分子多肽；100nM DMSO；100ng/ml LPS+1分子多肽；100ng/ml LPS+100nM DMSO。進(jìn)行雙熒光素酶檢測。結(jié)果顯示，小肽能有效抑制 IL-23p19 啟動子的活性(圖 2）。在沒有 LPS 刺激（M 組）的情況下子多肽組和 DMSO 組沒有明顯的差異。但當(dāng)有 LPS 刺激（LPS 組）時(shí)，小分子能明顯抑制 DMSO 組 IL-23p19 啟動子的活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P＜0.明小分子多肽能有效抑制 IL-23p19 啟動子的活性。

圖 2 小分子多肽處理顯著抑制 IL-23p19 啟動子的活性處理在 mRNA 水平抑制 IL-23p19 的表達(dá)多肽在體內(nèi)對 IL-23p19 mRNA 表達(dá)的影響，我們利M、10 nM、100 nM、1000 nM）處理小鼠骨髓來源樹突中。用 1ug/ml LPS 刺激，6 小時(shí)后收集細(xì)胞，提取YBR qPCR Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR（RT-PCR），以達(dá)。結(jié)果顯示（圖 3）：經(jīng)過小分子多肽處理后，樹3p19 mRNA 明顯下調(diào)，差異明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意分子多肽能有效抑制 IL-23p19mRNA 的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R773

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本文編號：2695987