本文關(guān)鍵詞：高糖經(jīng)p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管周細胞P2X7受體表達及炎癥介質(zhì)釋放，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:選擇性提取并鑒定原代牛視網(wǎng)膜微血管周細胞(BRPs),并選取P2或P3代BRPs為細胞模型來探討高糖對BRPs P2X7受體表達及其下游p38 MAPK信號通路的激活,以及細胞炎性介質(zhì)和粘附分子mRNA表達的作用和機理;并探討視網(wǎng)膜微血管周細胞內(nèi)的P2X7受體及其下游p38 MAPK信號通路之間是否存在相互影響。為糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期防治提供新的實驗證據(jù)和干預(yù)靶點。方法:1.將勻漿后的視網(wǎng)膜組織碎片,經(jīng)250目細胞過濾膜過濾后,收集濾過的組織碎片,并利用I型膠原酶消化后再分別利用100目及300目的細胞過濾膜過濾,收集下層細胞,即可提取得到原代的牛視網(wǎng)膜微血管周細胞,并采用倒置相差顯微鏡觀察視網(wǎng)膜毛細血管周細胞的形態(tài)。2.采用免疫細胞化學(xué)染色法,利用神經(jīng)元-膠質(zhì)抗原2(NG2)及波形蛋白(Vimentin)來進行牛視網(wǎng)膜微血管周細胞的鑒定。3.分別用5.6mM正糖,30mM高糖干預(yù)BRPs 24h;再分別加入100uM P2X7受體特異性激動劑BzATP干預(yù)1h;100uM P2X7受體拮抗劑A438079Hcl預(yù)干預(yù)BRPs 1h后再分別加用正糖及高糖干預(yù)BRPs 24h;10uM p38 MAPK信號通路阻斷劑SB203580預(yù)干預(yù)BRPs 24h后分別采用正糖和高糖干預(yù)BRPs 24h。然后分別檢測P2X7受體的mRNA表達以及蛋白的表達的水平,并檢測高糖、BzATP及A438079Hcl干預(yù)后p38 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平,明確高糖對P2X7受體表達的影響,以及P2X7受體與其下游p38 MAPK信號通路之間的相互作用;同時檢測各組炎癥因子IL-6及粘附分子ICAM-1的mRNA表達水平。結(jié)果:1.采用膠原酶消化牛視網(wǎng)膜組織團塊,并且利用細胞篩網(wǎng)選擇性過濾分離,可獲得具有良好活性,并且可傳代培養(yǎng)的原代視網(wǎng)膜微血管周細胞。周細胞在原代培養(yǎng)1天后,可見細胞貼壁生長且細胞狀態(tài)良好;大量細胞于接種培養(yǎng)3-5天后從培養(yǎng)皿底遷移長出;5-7天后可見視網(wǎng)膜微血管周細胞呈長梭形生長并形成較大的克隆;8-11天后長成短梭形的周細胞逐漸呈融合形態(tài),呈重疊生長。傳代培養(yǎng)后,1小時周細胞貼壁。平均5-7天左右能夠傳代一次。原代牛視網(wǎng)膜微血管周細胞傳代到第3代(P3)后逐漸開始出現(xiàn)老化狀態(tài)。2.牛視網(wǎng)膜微血管周細胞陽性表達神經(jīng)元-膠質(zhì)抗原2(Neuron-glial antigen 2,NG2)和波形蛋白(Vimentin);且陽性率大于98%。3.與對照組相比,高糖干預(yù)BRPs 24h后,高糖組周細胞膜上P2X7受體的mRNA和蛋白表達量均見明顯增加(均P0.05)。4.用P2X7受體特異性激動劑BzATP分別干預(yù)正糖及高糖培養(yǎng)24小時后的周細胞,干預(yù)1小時后可見,高糖+BzATP組的IL-6及ICAM-1的mRNA表達水平較對照組及高糖組明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。5.拮抗P2X7受體后,高糖+A438079Hcl組的周細胞其IL-6及ICAM-1的mRNA表達水平較高糖組明顯降低(均P0.05)。6.與對照組相比,高糖組周細胞p38 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平表達增加(均P0.05)。7.用A438079Hcl拮抗P2X7受體后可見,高糖+A438079Hcl組的p38 MAPK信號通路的磷酸化蛋白表達水平較高糖組明顯降低(均P0.05)。8.用SB203580預(yù)干預(yù)周細胞24小時后見,高糖+SB203580組的P2X7受體表達量較高糖組明顯降低;且高糖+SB203580組的IL-6及ICAM-1的mRNA表達水平較高糖組明顯降低(均P0.05)。結(jié)論:1.經(jīng)I型膠原酶消化,并分別利用250目、100目及300目的細胞篩網(wǎng),選擇性過濾分離視網(wǎng)膜組織后,所得細胞能持續(xù)培養(yǎng)并可傳代,經(jīng)細胞鑒定顯示已成功分離出BRPs,且細胞純度良好。2.第二代和第三代周細胞的生長狀態(tài)能更好的適應(yīng)于后續(xù)實驗。3.P2X7受體拮抗劑能抑制高糖所致的p38 MAPK信號通路的磷酸化蛋白表達以及IL-6和ICAM-1的合成;而阻斷p38 MAPK信號通路能抑制高糖所致的P2X7受體表達上調(diào)及IL-6和ICAM-1的合成。提示P2X7受體及其下游P38 MAPK信號通路互相影響并介導(dǎo)了高糖所致的視網(wǎng)膜周細胞炎性微環(huán)境的形成,共同參與構(gòu)成了高糖-P2X7受體-P38 MAPK通路激活-炎性因子和粘附分子合成增多的惡性循環(huán)。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 牛視網(wǎng)膜微血管周細胞 P2X7 受體 p38 MAPK 炎性微環(huán)境
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、牛視網(wǎng)膜微血管周細胞的培養(yǎng)及鑒定15-22
• 1.1 材料與方法15-16
• 1.1.1 組織來源15
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備15-16
• 1.1.3 主要試劑16
• 1.1.4 實驗主要試劑的配置16
• 1.2 實驗方法16-19
• 1.2.1 牛視網(wǎng)膜毛細血管周細胞原代培養(yǎng)及鑒定16-18
• 1.2.2 周細胞計數(shù)18
• 1.2.3 周細胞傳代培養(yǎng)18-19
• 1.3 實驗結(jié)果19-21
• 1.3.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察19-20
• 1.3.2 原代牛視網(wǎng)膜微血管周細胞鑒定20-21
• 1.4 小結(jié)21-22
• 二、高糖經(jīng)p38 MAPK調(diào)節(jié)BRPs P2X7受體及炎癥介質(zhì)表達22-40
• 2.1 對象與材料22-25
• 2.1.1 研究對象22
• 2.1.2 實驗主要儀器設(shè)備22-23
• 2.1.3 實驗主要試劑23
• 2.1.4 實驗主要試劑的配置23-25
• 2.2 實驗方法25-32
• 2.2.1 實驗分組25-26
• 2.2.2 Real-time PCR檢測牛BRPs P2X7受體、ICAM-1 及IL-6 的表達26-28
• 2.2.3 Western Blot檢測高糖對BRPs P2X7受體表達及其下游p38 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響28-31
• 2.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法31-32
• 2.3 實驗結(jié)果32-39
• 2.3.1 高糖干預(yù)后周細胞內(nèi)P2X7受體的m RNA及蛋白表達量情況32-33
• 2.3.2 高糖狀態(tài)下激活P2X7受體對炎性因子和粘附分子產(chǎn)生的影響33-34
• 2.3.3 拮抗P2X7受體對高糖培養(yǎng)的BRPs和粘附分子合成的影響34-35
• 2.3.4 高糖干預(yù)后周細胞p38 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平變化35-36
• 2.3.5 拮抗P2X7受體對周細胞p38 MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的影響36-37
• 2.3.6 阻斷p38 MAPK信號通路對P2X7受體表達及炎性因子和粘附分子合成的影響37-39
• 2.4 小結(jié)39-40
• 三、討論40-47
• 3.1 原代牛視網(wǎng)膜微血管周細胞模型的建立40-41
• 3.2 周細胞與糖尿病視網(wǎng)膜病變41
• 3.3 P2X7受體與糖尿病視網(wǎng)膜病變41-42
• 3.4 p38 MAPK信號通路與糖尿病視網(wǎng)膜病變42-43
• 3.5 視網(wǎng)膜微血管周細胞IL-6 及ICAM-1 的產(chǎn)生與糖尿病視網(wǎng)膜病變43-44
• 3.6 P2X7受體與P38 MAPK信號通路44-45
• 3.7 創(chuàng)新點與特色45-46
• 3.8 展望與不足46-47
• 結(jié)論47-49
• 參考文獻49-56
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明56-57
• 綜述 P2X7受體與糖尿病57-73
• 綜述參考文獻65-73
• 致謝73-75
• 個人簡歷75

  本文關(guān)鍵詞：高糖經(jīng)p38 MAPK途徑調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管周細胞P2X7受體表達及炎癥介質(zhì)釋放，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：267666