【摘要】：研究背景與目的視神經(jīng)損傷會(huì)引起RGC軸突凋亡及膠質(zhì)化反應(yīng),導(dǎo)致RGC軸突再生障礙,造成不可逆的視覺損傷。異�；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞釋放大量細(xì)胞毒性因子如TNF-α,IL-1β,NO和ROS,對(duì)RGC造成二次損傷。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)罌粟堿能夠抑制原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子,抑制其活化。cAMP與哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)元的發(fā)育、存活及軸突再生密切相關(guān),在許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Woo等人發(fā)現(xiàn),提高cAMP的含量能夠活化PKA,從而抑制BV2細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)IL-1β。MAPK/Erk級(jí)聯(lián)信號(hào)參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。Park等發(fā)現(xiàn),巖藻依聚糖通過(guò)下調(diào)MAPK(ERK,JNK,p38)途徑和Akt途徑減弱LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS,COX-2,IL-1β和TNF-α的表達(dá)。PI3K在細(xì)胞生長(zhǎng),粘附,分化和炎癥反應(yīng)中具有重要作用。為探究罌粟堿抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制,本課題組分析罌粟堿對(duì)cAMP/PKA,MEK/Erk,PI3K/Akt通路的影響,以及各通路對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α,IL-1β和IL-10的作用,并探究各信號(hào)通路之間的關(guān)系,為罌粟堿抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1研究材料分離純化新生SD大鼠的原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞,建立LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型。1.2研究方法用RT-PCR和ELISA分別檢測(cè)TNF-α,IL-1β和IL-10的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,觀察視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的異�；罨闆r。用western blot檢測(cè)信號(hào)通路的蛋白質(zhì)磷酸化水平,觀察各通路活化情況。分別加入cAMP抑制劑Rp-isomer,PKA抑制劑H89,MEK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002,進(jìn)一步研究各通路在罌粟堿抑制原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用以及各信號(hào)通路之間的關(guān)系。2結(jié)果2.1罌粟堿抑制TNF-α和IL-1β,促進(jìn)IL-10的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)2.2罌粟堿通過(guò)激活cAMP/PKA通路來(lái)抑制TNF-α和IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)罌粟堿上調(diào)cAMP含量,添加Rp-isomer和H89阻斷cAMP/PKA通路,TNF-α和IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)增加。2.3罌粟堿抑制MEK/Erk信號(hào)通路LPS上調(diào)MEK和Erk的磷酸化表達(dá),這些效果被罌粟堿阻斷。2.4 U0126減弱炎癥因子TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)LPS增加TNF-αmRNA和IL-1βmRNA,上調(diào)TNF-α和IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá),添加U0126顯著抑制以上效果。2.5 U0126增加抗炎因子IL-10的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)2.6 MEK/Erk通路受cAMP/PKA的部分調(diào)節(jié)添加Rp-isomer和H89阻斷cAMP/PKA通路,MEK和Erk的磷酸化水平增加。2.7罌粟堿激活PI3K/Akt通路,有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的趨勢(shì)罌粟堿上調(diào)PI3K和Akt的磷酸化水平,使用LY294002后TNF-α和IL-1β的表達(dá)出現(xiàn)增加趨勢(shì)。3結(jié)論罌粟堿通過(guò)cAMP/PKA和MEK/Erk通路抑制LPS誘導(dǎo)的原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并且MEK/Erk通路受cAMP/PKA通路的部分調(diào)節(jié)。
【圖文】：

圖 1 IBA-1 鑒定原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞分離、純化 SD 乳鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，固定，進(jìn)行 IBA-1 染色，觀察不同視野的 IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞呈多角、類圓形。2.2 罌粟堿抑制 TNF-α 和 IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，促進(jìn) IL-10的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)預(yù)置不同濃度的罌粟堿（0.4, 2, 10μg/ml）處理細(xì)胞 4 h，再加入 100ng/ml的 LPS 孵育 24 h。收集細(xì)胞，用 RT-PCR 方法檢測(cè)各因子 mRNA 的表達(dá)水平；收集上清液，用 ELISA 方法檢測(cè)各炎癥因子蛋白質(zhì)表達(dá)水平。如圖 2 所示，生理狀態(tài)下，，原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中 TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄水平（圖 2a）和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖 2b）是極低的，LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，顯著上調(diào) TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，而不同濃度的罌粟堿能夠降低TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)（n=5，與 LPS 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01）。如圖 3 所示，生理狀態(tài)下，原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞中 IL-10 的 mRNA 表達(dá)

17圖 2 罌粟堿抑制小膠質(zhì)細(xì)胞 TNF-α 和 IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)預(yù)置不同濃度的罌粟堿（0.4, 2, 10μg/ml）處理細(xì)胞 4 h，再加入 100ng/ml 的 LPS 孵育24 h。LPS 顯著上調(diào) TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄（a）和蛋白質(zhì)表達(dá)（b），不同濃度的罌粟堿能夠降低 TNF-α、IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)（n=5），與 LPS 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。圖 3 罌粟堿促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞 IL-10 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R774

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本文編號(hào)：2636080