【摘要】：miR-203a-3p常表達(dá)于多種惡性腫瘤,其低表達(dá)與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)。本研究的目的是探討miR-203a-3p及其直接靶基因VEGFC對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管擬態(tài)形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為的影響及相關(guān)作用機(jī)制,進(jìn)而為鼻咽癌的分子診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。本研究主要分為四個(gè)部分:第一部分:運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和C666-1中miR-203a-3p的表達(dá)水平,運(yùn)用RT-PCR和免疫熒光方法檢測(cè)15例鼻咽癌病理組織及8例癌旁組織和兩種鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和C666-1中VEGFC的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量明顯降低,而VEGFC在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)量明顯升高。第二部分:探討miR-203a-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將外源合成的miR-203a-3p mimics和miR-203a-3p inhibit以及各自的陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、C666-1中,通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miR-203a-3p表達(dá),研究miR-203a-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期、血管擬態(tài)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的影響,同時(shí)建造裸鼠皮下荷瘤模型,研究miR-203a-3p對(duì)鼻咽癌體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞集落形成能力;通過(guò)流式細(xì)胞儀PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的改變;使用Transwell小室系統(tǒng)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力;通過(guò)血管擬態(tài)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的血管成管現(xiàn)象;通過(guò)建立裸鼠皮下荷瘤模型,檢測(cè)miR-203a-3p對(duì)鼻咽癌體內(nèi)生長(zhǎng)的影響;運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-203a-3p的過(guò)表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力,并將鼻咽癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng);同時(shí)miR-203a-3p能有效抑制鼻咽癌的體內(nèi)生長(zhǎng);miR-203a-3p能顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力;同時(shí)miR-203a-3p的過(guò)表達(dá)可以減少鼻咽癌細(xì)胞血管成管現(xiàn)象和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。第三部分:為了探討miR-203a-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為抑制作用的機(jī)制,我們檢測(cè)了miR-203a-3p的靶基因。通過(guò)檢索生物信息學(xué)網(wǎng)站,發(fā)現(xiàn)VEGFC可以作為miR-203a-3p的直接靶基因。通過(guò)在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、C666-1中轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimics,發(fā)現(xiàn)VEGFC的表達(dá)量明顯降低,轉(zhuǎn)染miR-203a-3p inhibit,VEGFC的表達(dá)量明顯增多,表明miR-203a-3p能有效抑制VEGFC基因的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-203a-3p和GLA-VEGFC-3蔝TR-wild質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染抑制了熒光素酶活性,減弱熒光強(qiáng)度,表明VEGFC是miR-203a-3p的直接靶點(diǎn)。第一部分已經(jīng)證實(shí)VEGFC在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),可能起促癌基因的作用,為了探索VEGFC在鼻咽癌中的作用機(jī)制,通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀PI染色法、Transwell小室實(shí)驗(yàn)、血管擬態(tài)形成實(shí)驗(yàn)和Western blot等進(jìn)一步研究VEGFC對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾VEGFC的表達(dá)明顯抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖、血管擬態(tài)形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力無(wú)明顯影響。第四部分:為了進(jìn)一步探索miR-203a-3p/VEGFC對(duì)鼻咽癌調(diào)節(jié)作用的機(jī)制,運(yùn)用Western blot檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)情況。首先驗(yàn)證了干擾VEGFC的表達(dá),能顯著下調(diào)p-AKT的表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)AKT蛋白的表達(dá)。隨后又發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p過(guò)表達(dá),能顯著下調(diào)VEGFC、p-AKT的蛋白水平,同時(shí)上調(diào)AKT蛋白的表達(dá);抑制miR-203a-3p的表達(dá),VEGFC表達(dá)上調(diào),下調(diào)AKT的表達(dá)下調(diào),同時(shí)上調(diào)p-AKT蛋白的表達(dá),表明miR-203a-3p可以通過(guò)下調(diào)VEGFC的表達(dá)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。結(jié)論:miR-203a-3p在鼻咽癌中低表達(dá),通過(guò)直接結(jié)合VEGFC的3蔝TR區(qū)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、血管擬態(tài)形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。miR-203a-3p可以通過(guò)下調(diào)VEGFC的表達(dá)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。
【圖文】：

VEGFC在鼻咽癌組織中的表達(dá)量在鼻咽癌細(xì)胞系中VEGFC的表達(dá)量明顯升高

VEGFC在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量免疫熒光結(jié)果顯示VEGFC在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平較非腫瘤組織明顯
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2634424