發(fā)布時(shí)間：2020-04-20 04:14

【摘要】：目的:研究在C57BL/6小鼠煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus,AF)感染的真菌性角膜炎中降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)表達(dá)變化,并探討CGRP在真菌性角膜炎發(fā)病過程中的相關(guān)作用。方法:1.將6-8周SPF級(jí)的雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與真菌角膜炎組,采用把2μL煙曲霉菌分生孢子(2.5×10~4CFU/μL)向C57BL/6小鼠角膜基質(zhì)內(nèi)注射的方式,建立1天、3天和5天的真菌性角膜炎小鼠動(dòng)物模型。在裂隙燈下拍攝1、3和5天小鼠角膜煙曲霉菌感染情況并分別記錄每個(gè)小鼠角膜的臨床評(píng)分。分別采用real-time PCR、Western Bolt檢測(cè)小鼠對(duì)照組角膜與煙曲霉菌性角膜炎中CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)變化情況,并采用組織免疫熒光測(cè)定CGRP在小鼠角膜的蛋白定位。2.采用3%硫代乙醇培養(yǎng)基提取C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,并使用滅活的煙曲霉菌菌絲分別刺激4、8、12小時(shí)后,采取real-time PCR和Western Bolt檢測(cè)巨噬細(xì)胞中CGRP的mRMA及蛋白表達(dá)變化。用煙曲霉菌菌絲刺激小鼠巨噬細(xì)胞8小時(shí)后,用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞CGRP的定位情況。3.給予外源性CGRP或CGRP的拮抗劑CGRP_(8-37)對(duì)小鼠腹腔提取的巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理30 min,再用煙曲霉菌滅活菌絲刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí)之后,采用real-time PCR法檢測(cè)不同炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、MIP-2、TGF-β和IL-10的基因表達(dá)水平變化。外源性CGRP或CGRP_(8-37)預(yù)處理巨噬細(xì)胞30分鐘后,使用煙曲霉菌滅活菌絲刺激小鼠巨噬細(xì)胞24小時(shí),用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液中促炎因子IL-1β及TNF-α蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果:1.與小鼠對(duì)照組角膜相比較,煙曲霉菌分生孢子感染小鼠角膜第1天與第3天后神經(jīng)肽CGRP mRNA表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而第5天時(shí)真菌組小鼠角膜中CGRP mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變。第1、3和5天時(shí)真菌組小鼠角膜的CGRP蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組角膜組相比均有提升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且煙曲霉菌分生孢子感染角膜組的臨床評(píng)分均明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.與對(duì)照組巨噬細(xì)胞組相比較,用滅活的煙曲霉菌菌絲刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞4、8和12小時(shí)后CGRP的mRNA表達(dá)水平及CGRP蛋白表達(dá)水平都有明顯升高,并且在煙曲霉菌菌絲刺激8小時(shí)后CGRP mRNA及蛋白的表達(dá)水平可以達(dá)高峰,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞免疫熒光顯示CGRP蛋白主要在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá),煙曲霉菌刺激后CGRP的表達(dá)水平升高。3.給予外源性CGRP對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理之后再建立煙曲霉菌刺激的巨噬細(xì)胞模型,與單純的煙曲霉菌菌絲刺激組相比較,CGRP+煙曲霉菌組的促炎因子IL-1β及TNF-α在mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平上明顯降低,IL-6的mRNA表達(dá)水平亦有所下降,抑炎因子IL-10的mRNA表達(dá)提高;而MIP-2及TGF-β的mRNA變化水平無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。拮抗劑CGRP_(8-37)預(yù)處理后,促炎因子IL-1β及TNF-αmRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均有提高,并且IL-6的mRNA表達(dá)也明顯提高,然而IL-10、MIP-2及TGF-βmRNA水平表達(dá)無(wú)明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:C57BL/6小鼠角膜感染煙曲霉菌后,CGRP的蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平均有提高,提示內(nèi)源性神經(jīng)肽CGRP可以參與真菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)。外源性CGRP預(yù)處理煙曲霉菌感染的巨噬細(xì)胞可以降低促炎因子的表達(dá)水平,增加抑炎因子的表達(dá);使用CGRP_(8-37)預(yù)處理后可以增加促炎因子的表達(dá),提示CGRP在煙曲霉菌性角膜炎中可以起到抗炎作用。
【圖文】：

（A-B）煙曲霉菌菌絲及分生孢子形態(tài)

附錄圖 2.（A-E）小鼠煙曲霉菌性角膜炎中 CGRP 的表達(dá)情況。（A）和（B）為小鼠角膜感染煙曲霉菌后 1d、3d、5d 在裂隙燈顯微鏡下拍照及臨床評(píng)分；（C）和（D）為CGRPmRNA 和蛋白在感染煙曲霉菌后的表達(dá)情況；（E）是對(duì) CGRP 進(jìn)行免疫熒光染色綠色的代表 CGRP，藍(lán)色的代表 DAPI。aP<0.05,bP<0.001。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R772.21

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本文編號(hào)：2634139