發(fā)布時間：2020-04-19 22:25

【摘要】：目的:本研究旨在揭示TL1A在非增生期糖尿病性視網(wǎng)膜病變中的變化趨勢及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,探究TL1A在疾病狀態(tài)下對血-視網(wǎng)膜屏障所發(fā)揮的保護作用及機理。方法:體外實驗:(1)通過高糖刺激人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRMEC)以及大鼠條件性永生化視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(i RRMEC),建立高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮滲漏的體外模型;并通過Western Blot及RT-q PCR的方式檢測TL1A在經(jīng)高糖處理后的表達(dá)變化。(2)通過motif分析的方式,預(yù)測可能調(diào)節(jié)TL1A的轉(zhuǎn)錄因子;利用WB以及免疫熒光染色(IF)檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在高糖狀態(tài)下的變化情況,并通過Ch IP-q PCR、Luciferase assay以及si RNA等實驗驗證相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對TL1A的調(diào)控功能。(3)利用TL1A重組蛋白處理內(nèi)皮細(xì)胞,研究TL1A在高糖環(huán)境下對血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白VE-Cadherin的保護作用;同時利用探針跳躍式離子電導(dǎo)顯微鏡(HPICM)以及生物素-親和素系統(tǒng)驗證TL1A對高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性破壞的保護作用。(4)利用免疫共沉淀(Co-IP)探究TL1A對高糖導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性破壞的保護機制。體內(nèi)實驗:(1)通過給予雄性Wistar大鼠腹腔注射STZ的方式,建立糖尿病性視網(wǎng)膜血管滲漏的體內(nèi)模型。(2)利用改良版Miles實驗驗證TL1A重組蛋白對糖尿病性血管滲漏的保護作用,同時尋找大鼠玻璃體腔注射TL1A重組蛋白的最佳劑量及干預(yù)時間。(3)利用IF方法觀察大鼠玻璃體腔注射TL1A重組蛋白對糖尿病性視網(wǎng)膜血管滲漏的保護作用。結(jié)果:體外實驗:(1)高糖刺激2小時可以引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin p-Tyr685位點激活,導(dǎo)致血管滲漏。與此同時,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中TL1A的表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05)。(2)高糖刺激下FOXP1表達(dá)升高,并負(fù)向調(diào)控TL1A的表達(dá)(P0.05)。(3)體外給予TL1A重組蛋白250ng/ml或者內(nèi)源性過表達(dá)TL1A可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的VE-cadherin磷酸化,改善高糖引起的血管滲漏(P0.05)。(4)TL1A與其受體DR3結(jié)合可以抑制Src p-Tyr416的磷酸化,進(jìn)而抑制VE-Cadherin p-Tyr685的磷酸化,從而保護內(nèi)皮細(xì)胞間粘附連接。體內(nèi)實驗:(1)糖尿病2周模型可以檢測到TL1A表達(dá)量下降,但隨疾病模型時間延長TL1A表達(dá)量有所回升。(2)糖尿病2周模型玻璃體腔注射0.1ng TL1A重組蛋白可以避免蛋白本身所引起的視網(wǎng)膜出血及滲出。(3)糖尿病2周模型玻璃體腔注射TL1A重組蛋白可以改善糖尿病性視網(wǎng)膜血管滲漏。結(jié)論:(1)高糖誘導(dǎo)的人和大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及DR模型導(dǎo)致的TL1A表達(dá)下降,可能參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變中病理性血管滲漏的發(fā)生。(2)早期進(jìn)行低劑量TL1A干預(yù)可以延緩糖尿病性視網(wǎng)膜血管滲漏的發(fā)展。此研究可能為糖尿病性視網(wǎng)膜病變的治療提供新靶點。
【圖文】：

21圖1.1 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管滲漏模型的建立。圖1.1A示人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型建立相關(guān)分子指標(biāo)蛋白水平檢測。圖1.1B示各分子指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量（n=3，* P<0.05 vs. Normal）。圖1.1C示免疫熒光染色觀察正常組及高糖刺激24小時組細(xì)胞間VE-Cadherin蛋白形態(tài)及分布情況（×400），箭頭所示為明顯的鋸齒狀改變及細(xì)胞間隙斷裂。圖1.1D示正常組及高糖刺激24小時組細(xì)胞間粘附連接蛋白分布統(tǒng)計情況。圖1.1E示正常及高糖刺激24小時組細(xì)胞間縫隙指數(shù)分析統(tǒng)計情況。（n=3，* P<0.05）。1.2.1.2 大鼠條件性永生化視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞血管滲漏模型的建立用Western Blot方法檢測不同糖濃度狀態(tài)下滲透壓對內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin蛋白活化的影響。如圖1.2所示，甘露醇40mmol/L刺激8小時不會引起VE-Cadherin賴氨酸685位點的活化，但在甘露醇50mmol/L刺激狀態(tài)下，蛋白表達(dá)量明顯增加。圖1.2 高糖狀態(tài)下滲透壓對大鼠條件性永生化視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的影響。甘露醇40mmol/L時，VE-Cadherin賴氨酸685位點低表達(dá)

1.2.1.2 大鼠條件性永生化視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞血管滲漏模型的建立用Western Blot方法檢測不同糖濃度狀態(tài)下滲透壓對內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin蛋白活化的影響。如圖1.2所示，甘露醇40mmol/L刺激8小時不會引起VE-Cadherin賴氨酸685位點的活化，但在甘露醇50mmol/L刺激狀態(tài)下，蛋白表達(dá)量明顯增加。圖1.2 高糖狀態(tài)下滲透壓對大鼠條件性永生化視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的影響。甘露醇40mmol/L時，VE-Cadherin賴氨酸685位點低表達(dá)，甘露醇50mmol/L時，VE-Cadherin賴氨酸685位點高表達(dá)。用Western Blot 方法檢測高糖刺激后各時間點血管滲漏相關(guān)指標(biāo)的變化。條件性永生化大?
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R774.1

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本文編號：2633804