【摘要】：目的:運用靶向序列捕獲測序技術(shù)對98個遺傳性耳聾家系進行分子病因?qū)W的分析,以期能夠明確其致病原因,探究更多已知基因的致聾機制并發(fā)現(xiàn)新的致病位點,為耳聾的預防、診斷和治療奠定分子病因?qū)W基礎(chǔ)。方法:選取課題組遺傳性耳聾基因庫中98例沒有檢測到GJB2、SLC26A4常見位點及線粒體DNA1555和1494變異位點的耳聾家系,分析先證者及家庭成員的病史、聽力學、影像學及體格檢查資料。選擇血液基因組試劑盒法提取基因組DNA,使用個性化定制的耳聾基因Panel對目前所報道的己知耳聾基因(包括245個核基因和線粒體基因)進行靶向捕獲并富集,然后再使用Illumina測序平臺進行二代測序。通過生物信息學分析篩選出可能致病的變異,最后對所有發(fā)現(xiàn)的可能致病變異的基因片段上下游設(shè)計引物,進行PCR擴增后用于Sanger測序,將所得結(jié)果與標準序列比對,從而明確責任基因及變異。同期收集207例聽力正常人群的臨床資料及血樣作為對照組。結(jié)果:1、臨床病史資料分析結(jié)果:98例先證者中,綜合征型耳聾患者1例,非綜合征耳聾患者97例。常染色體顯性遺傳家系8例,常染色體隱性遺傳家系90例。聽力學檢查結(jié)果分析:中度感音神經(jīng)性耳聾4例,中重度感音神經(jīng)性耳聾6例,重度感音神經(jīng)性耳聾8例,極重度感音神經(jīng)性耳聾80例,其中語前聾90例,語后聾8例。2、98例樣本共發(fā)現(xiàn)181個基因的1127種非同義或剪接位點變異,其中非同義變異1011種,無義變異30種,移碼插入缺失變異86種。其中129個基因是目前已知與耳聾相關(guān)的,總共有937種變異;而另52個基因是在其他物種有報道與耳聾相關(guān)但是在耳聾人群中沒有報道或在其他疾病中報道過與線粒體功能相關(guān)但在耳聾人群中沒有發(fā)現(xiàn)的基因,這52個基因共檢測到190種變異。3、98例樣本中,在32例常染色體隱性遺傳性耳聾先證者鑒定出35種純合變異,其中有7個變異已經(jīng)報道過,其中:CDH23:c.C719T(p.Pro240Leu);LHFPL5:c.C494T(p.Thr165Met);MYO15A:c.6340GA(p.Val2114Met);OTOF:c.2977_2978del;SLC26A4:c.T716A(p.Val239Asp)以及TMPRSS3:c.G727A(p.Gly243Arg)均有研究證據(jù)支持其屬于致病變異。PCDH15:c.1195AC(p.Ser399Arg)在其他研究者的結(jié)果中屬于致病性不確切,需要更多的研究數(shù)據(jù)明確其致病性。在29個新發(fā)現(xiàn)的變異中,15個是無義變異或移碼插入缺失變異,14個為錯義變異,上述變異通過同源序列比對發(fā)現(xiàn)它們均處于蛋白質(zhì)功能保守區(qū);通過Mutation Taster,Polyphen2_HVAR和SIFT預測程序中至少一個預測結(jié)果為致病,且在207例正常聽力對照組中并未發(fā)現(xiàn)上述變異,提示它們可能改變了編碼蛋白的結(jié)構(gòu)或功能,從而引起耳聾的可能。4、98例樣本中,在8個顯性遺傳性耳聾先證者中鑒定出了3個致病變異,其中SOX10:c.342GA(p.Trp114X)為未報道過的新的致病變異,其導致Waardenburg綜合征2E型,且207個正常聽力對照組中沒有發(fā)現(xiàn)該變異。其余兩個變異GJB2:c.551GA(p.Arg184Gln)、WFS1:c.2051CT(p.Ala684Val)已有報道,表明其分別與常染色體顯性遺傳性耳聾3A型、常染色體顯性遺傳性耳聾6/14/38型相關(guān)。結(jié)論:1、本研究在98例樣本中,為32例常染色體隱性遺傳性耳聾先證者及8例顯性遺傳性耳聾家系明確了致病原因。該結(jié)果將為這些家系的遺傳性耳聾提供明確的分子病因?qū)W診斷及有效的遺傳咨詢,為其耳聾預防、診斷及治療提供了有力的理論指導。2、本研究在已知的耳聾基因中發(fā)現(xiàn)29個新變異,采用生物信息學方法預測了其致病的可能性。這些研究結(jié)果為后續(xù)的功能研究提供了理論基礎(chǔ),同時不僅為更多的耳聾家庭明確分子病因?qū)W診斷,也為耳聾基因庫增添了新的成員3、本次研究發(fā)現(xiàn)的190種變異需要更多的研究(包括病例篩查及功能驗證等)確定其在耳聾人群中的致病性。4、本次研究結(jié)果提示,在常染色體隱性遺傳性耳聾患者中,除GJB2、SLC26A4及線粒體DNA m.1555AG和m.1494CT變異為常見的致聾基因,MYO15A基因、CDH23基因、OTOF基因、FGF3基因也可作為常規(guī)致聾基因的候選基因,為耳聾的臨床診斷提供了更多的選擇,也為將來設(shè)計中國西北地區(qū)新生兒耳聾基因篩查試劑盒提供更多的理論支持。
【圖文】：

2.4.2 測定 DNA 得率和純度將所獲的基因組 DNA 通過分光光度計測定提取量，空白對照用上述步驟所使用的洗脫液做。DNA 純度測定采用 260 nm 和 280 nm 測定光吸值做對比的方法，參考當 A260/A280 比值在 1.7-1.9，，表明該樣本的 DNA 純度在 85%-90%。記錄每個樣品的純度及濃度，樣本量多時可進行分裝標記，避免反復多次凍融。2.4.3 耳聾基因二代測序流程1.目標基因捕獲：本研究采用 Agilent 液相芯片捕獲系統(tǒng)，對人的全外顯子區(qū)域 DNA 進行高效富集。采用 Agilent SureSelect HumanAll ExonV5 試劑盒實驗流程操作進行建庫和捕獲實驗。用 Covaris 破碎儀將提前提取的基因組 DNA 隨機打斷成長度為 180-280bp 的片段，通過在末端修復和加 A 尾操作后在片段兩端分別連接上接頭以制備 DNA 文庫。將帶有特異 index 的文庫 pooling 后與生物素標記的探針進行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將 246 個基因的外顯子捕獲下來，文庫質(zhì)檢是經(jīng) PCR 線性擴增進行的，合格的方可用于進行下一步測序。2.測序策略：Illumina HiSeq 2500 PE125 測序。

蘭州大學碩士學位論文 基于二代測序技術(shù)的遺傳性耳聾分子病因?qū)W研究other 693.2.2 變異頻率統(tǒng)計經(jīng)過濾掉除 exonic 區(qū)域非同義變異（或者移碼變異）和 splicing 區(qū)域以外的變異位點后，SNV 有 4307 個，Indel 有 173 個。其中 SNV 及 Indel 變異頻率分別如圖 2,圖 3 所示。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R764.43

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本文編號：2617535