【摘要】：目的和意義胃內(nèi)容物反流至咽喉,引起的咽喉反流性疾病(Larynghopharyngeal reflux disease,LPRD)受到耳鼻咽喉科學(xué)界廣泛關(guān)注,由于咽喉反流的致病機(jī)制不清,至今缺少診斷LPRD特異性方法和的診斷金標(biāo)準(zhǔn),治療上也存在接近50%的患者用質(zhì)子泵抑制劑抑酸治療效果欠佳。文獻(xiàn)證實(shí)胃蛋白酶(pepsin)是LPRD的主要損傷因子,但是,pepsin是如何損傷咽喉粘膜上皮的機(jī)制不清楚,研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)研究建立人喉粘膜原代細(xì)胞株,研究pepsin損傷喉粘膜上皮的機(jī)制,為咽喉反流性疾病的致病機(jī)制提供新理論,并探索新的治療策略。方法手術(shù)中取聲門下、室?guī)А?huì)厭、環(huán)后等不同部位正常人喉組織,通過(guò)兩步酶加組織研磨法進(jìn)行喉上皮原代細(xì)胞培養(yǎng)。構(gòu)建pLVTHM-BMI-1質(zhì)粒,慢病毒感染喉上皮原代細(xì)胞誘導(dǎo)其永生化,Westem blot檢測(cè)BMI-1、hTERT、p53及pRB通路各蛋白的表達(dá)水平,探究BMI-1感染喉上皮細(xì)胞后引起的分子生物學(xué)變化。并通過(guò)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)、EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證永生化細(xì)胞株功能特性。在pH=7環(huán)境下,用不同濃度pepsin(Omg/ml、0.1mg/ml和1mg/ml)刺激喉上皮永生化細(xì)胞,通過(guò)氧化應(yīng)激檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)及彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ROS生成,線粒體損傷及細(xì)胞核DNA損傷情況。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)炎性細(xì)胞因子(IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL8、IL10、IL18)表達(dá)情況。加入NADPH氧化抑制劑(DPI和Apocynin)或ROS清除劑(Tempol)預(yù)處理后,觀察其對(duì)pepsin線粒體損傷、炎性細(xì)胞因子表達(dá)及細(xì)胞核DNA損傷的影響。進(jìn)一步通過(guò)Western blotting檢測(cè)DNA損傷標(biāo)物p-H2AX以及ROS通路蛋白表達(dá),從而探索Pepsin通過(guò)ROS介導(dǎo)喉上皮DNA損傷的可能機(jī)制。選用標(biāo)本庫(kù)中有詳盡的多通道腔內(nèi)阻抗PH檢測(cè)數(shù)據(jù),與咽喉反流相關(guān)的聲帶息肉組織標(biāo)本(32例)及健康志愿者喉粘膜標(biāo)本(16例),進(jìn)行p-H2AX和8-OHdG免疫組化染色,探究聲帶息肉組織中pepsin與DNA損傷的關(guān)系。結(jié)果1.喉原代細(xì)胞培養(yǎng)及永生化細(xì)胞株構(gòu)建(1)成功培養(yǎng)出喉上皮原代細(xì)胞通過(guò)酶消化法加組織研磨成功培養(yǎng)出喉腔不同區(qū)域原代細(xì)胞(包括環(huán)后、會(huì)厭、聲門下、室?guī)?,光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)為類圓形,光鏡下折光性好,呈鋪路石樣貼壁生長(zhǎng),存在接觸抑制現(xiàn)象,能成功傳代,CK表達(dá)陽(yáng)性,證明該細(xì)胞來(lái)自上皮。(2)建立穩(wěn)定表達(dá)BMI-1的聲門下及室?guī)Ъ?xì)胞本課題組利用BMI-1介導(dǎo)建立并驗(yàn)證了兩株永生化喉上皮細(xì)胞(聲門下BMI-1細(xì)胞與室?guī)MI-1細(xì)胞),通過(guò)qPCR及Wb提示BMI-1的過(guò)表達(dá),端粒酶檢測(cè)提示,hTERT蛋白水平升高,端粒酶活性增加,western blotting提示過(guò)表達(dá)BMI-1后p16、p21的表達(dá)逐漸降低,同時(shí)磷酸化RB的表達(dá)增高。(3)聲門下BMI-1與室?guī)MI-1細(xì)胞功能學(xué)研究通過(guò)β-半乳糖苷酶衰老分析實(shí)驗(yàn)、Edu增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)提示喉上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染BMI-1后,衰老細(xì)胞顯著減少,細(xì)胞活性增強(qiáng),處于S期細(xì)胞增多,細(xì)胞增殖加快。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)提示室?guī)掀ぜ?xì)胞、聲門下細(xì)胞,聲門下BMI-1與室?guī)MI-1細(xì)胞未見(jiàn)腫物形成,Hep-2細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照可見(jiàn)腫物形成。2.Pepsin對(duì)喉上皮細(xì)胞的損傷作用通過(guò)用不同濃度的pepsin(Omg/ml、0.lmg/ml、lmg/ml)在pH7環(huán)境下刺激聲門下BMI-1與室?guī)MI-1細(xì)胞,結(jié)果提示隨著pepsin濃度的增高,ROS生成升高,線粒體膜電位增加,炎性細(xì)胞因子(IL1α、IL1[β、IL6、IL8)分泌量上調(diào),并且DNA損傷加重。3.Pepsin通過(guò)ROS介導(dǎo)喉上皮損傷機(jī)制研究加入NADPH氧化抑制劑(Apocynin和DPI)和ROS清除劑(Tempol)后ROS生成量、線粒體損傷、炎性細(xì)胞因子分泌及DNA損傷顯著減少。pepsin刺激后p-ERK、p-JNK、c-Jun蛋白表達(dá)上調(diào),加入apocynin預(yù)處理表達(dá)顯著下調(diào)。4.聲帶息肉中Pepsin與氧化應(yīng)激DNA損傷關(guān)系聲帶息肉組組織中8-OHdG、P-H2AX免疫組化染色強(qiáng)度均高于正常人群組(P0.01)。聲帶息肉中Pepsin表達(dá)與8-OHdG、P-H2AX表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.348,P=0.008和r=0.254,P=0.041)。P-H2AX評(píng)分與8-OHdG評(píng)分基本相似,與咽喉酸反流立位和總數(shù)的四項(xiàng)參數(shù)(包括酸反流次數(shù)、酸反流時(shí)間、酸反流時(shí)間百分比、平均酸清除時(shí)間)之間有顯著正相關(guān)(P0.05);與食道酸反流參數(shù)中立位及總pH4時(shí)間、最長(zhǎng)反流時(shí)間之間有顯著正相關(guān)(P0.05)。結(jié)論1.成功培養(yǎng)出環(huán)后、會(huì)厭、聲門下、室?guī)г?xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)BMI-1的聲門下及室?guī)в郎?xì)胞株。2.pepsin刺激促進(jìn)喉上皮細(xì)胞DNA及線粒體損傷、ROS生成增加、炎癥因子分泌增加。3.pepsin通過(guò)ROS/MAPK/炎癥信號(hào)通路引起喉上皮細(xì)胞DNA損傷。4.聲帶息肉中pepsin與DNA氧化損傷密切相關(guān)。
【圖文】：

現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，此時(shí)成纖維細(xì)胞占培養(yǎng)物的＜５％，在光學(xué)顯微鏡下觀察到成纖維逡逑細(xì)胞樣的形態(tài)，每視野不到５個(gè)細(xì)胞，其中約有１５０個(gè)細(xì)胞。用胰酶消化傳逡逑代，ＤＭＥＭ高糖完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞能成功傳代（圖１－１）。逡逑種板后邐—邐ＤＡＹ２邋邐逡逑■ｋｖ．＃ｔ邋－ｆ邐＾邋＾邋ａ邋■邋＊＊邐＾逡逑＼Ｚ．－邋￣＊邋＾邐＞？．邋－邋：邋－邐■－．？？Ｔ－－邋■邐；邐ｉｍＴｘ邋｜｜ｌ＞邐＾邐—邋＿逡逑－邐，＆■邐ｖ－ｔ邋＾邋ｉ１逡逑Ｓ邋？：．－ｆ邋＿邋ｆｒ說(shuō)泛％邋—邋厶逡逑ＤＡＹ６邐ＤＡＹ１４逡逑圖１－１．喉上皮原代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程及形態(tài)（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｌａｒｙｎｇｅａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋（２００Ｘ）逡逑２２逡逑

現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，此時(shí)成纖維細(xì)胞占培養(yǎng)物的＜５％，在光學(xué)顯微鏡下觀察到成纖維逡逑細(xì)胞樣的形態(tài)，每視野不到５個(gè)細(xì)胞，，其中約有１５０個(gè)細(xì)胞。用胰酶消化傳逡逑代，ＤＭＥＭ高糖完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞能成功傳代（圖１－１）。逡逑種板后邐—邐ＤＡＹ２邋邐逡逑■ｋｖ．＃ｔ邋－ｆ邐＾邋＾邋ａ邋■邋＊＊邐＾逡逑＼Ｚ．－邋￣＊邋＾邐＞？．邋－邋：邋－邐■－．？？Ｔ－－邋■邐；邐ｉｍＴｘ邋｜｜ｌ＞邐＾邐—邋＿逡逑－邐，＆■邐ｖ－ｔ邋＾邋ｉ１逡逑Ｓ邋？：．－ｆ邋＿邋ｆｒ說(shuō)泛％邋—邋厶逡逑ＤＡＹ６邐ＤＡＹ１４逡逑圖１－１．喉上皮原代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程及形態(tài)（２００Ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ａｎｄ邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｌａｒｙｎｇｅａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋（２００Ｘ）逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R766.5

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本文編號(hào)：2618229