【摘要】：目的:探討PAX6對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)的生物學(xué)特性的影響及其潛在作用機(jī)制。方法:分別用過(guò)表達(dá)PAX6慢病毒重組質(zhì)粒載體p-CDH-CMV-MCS-EF1-CopGFR-T2A-Puro和干擾載體pSICOR-shPAX6對(duì)mESCs進(jìn)行感染,對(duì)感染后的細(xì)胞進(jìn)行PAX6、GFP免疫熒光染色鑒定;感染效率采用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證;采用CCK8法檢測(cè)PAX6對(duì)mESCs增殖能力的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)PAX6對(duì)mESCs周期的影響;于條件培養(yǎng)的第7天在顯微鏡下觀察各組mESCs的形態(tài)變化;Western blot檢測(cè)角膜緣干細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白K5、K14,PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表達(dá);葡萄糖生化試劑盒和ATP檢測(cè)試劑盒分別被用來(lái)檢測(cè)mESCs葡萄糖和ATP含量的變化。結(jié)果:慢病毒重組質(zhì)粒載體感染mESCs后,免疫熒光染色鑒定結(jié)果顯示PAX6過(guò)表達(dá)組mESCs可見(jiàn)PAX6表達(dá),對(duì)照組、過(guò)表達(dá)空載體組與PAX6干擾組未見(jiàn)PAX6表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示PAX6過(guò)表達(dá)組可見(jiàn)PAX6蛋白表達(dá),對(duì)照組,過(guò)表達(dá)空載體組與PAX6干擾組未見(jiàn)PAX6蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比,相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下,PAX6過(guò)表達(dá)組能夠抑制mESCs的增殖,而PAX6干擾組能夠促進(jìn)mESCs的增殖,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),PAX6干擾組促進(jìn)mESCs增殖的效果更加明顯。PAX6過(guò)表達(dá)組的mESCs細(xì)胞周期G1期出現(xiàn)阻滯。光鏡下觀察各組mESCs在第7天的細(xì)胞形態(tài)變化,結(jié)果顯示,四組細(xì)胞均呈圓形或橢圓形,邊界清晰,與對(duì)照組相比,PAX6干擾組細(xì)胞較為松散,而PAX6過(guò)表達(dá)組mESCs則排列緊密,呈集落狀生長(zhǎng),呈現(xiàn)出向角膜緣干細(xì)胞樣細(xì)胞過(guò)渡的形態(tài)。與對(duì)照組相比,PAX6過(guò)表達(dá)組蛋白K5、K14表達(dá)量明顯升高。與對(duì)照組相比,PAX6過(guò)表達(dá)組、PAX6過(guò)表達(dá)+BKM120組和BKM120組的p-PI3K,p-AKT,p-P70S6K,GLUT1蛋白表達(dá)量顯著降低(P0.05),mESCs內(nèi)ATP和葡萄糖含量出現(xiàn)不同程度的減少(P0.05)。結(jié)論:PAX6通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性,減少mESCs的ATP及葡萄糖含量,從而抑制mESCs的增殖;PAX6可誘導(dǎo)mESCs向LSCs分化,并促進(jìn)角膜分化標(biāo)志蛋白K5、K14的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1. mESCs 細(xì)胞培養(yǎng)光鏡圖（100×）Figure .1 ESCs cell culture.A. MESCs cells cultured in MEF feeding layer; B. MESCs cellscultured without MEF feeder layer; C. mESCs cell alkaline phosphataseAPstaining.2.1.2 SSEA1、OCT4 免疫熒光染色單克隆抗體 SSEA1 mouse mAb 加 anti-mouse IgG-CY3，OCT4 rabbit mAb 加anti-rabbit IgG-CY3 染色，，可見(jiàn) mESCs 胞質(zhì)內(nèi) OCT4 陽(yáng)性表達(dá)（紅色熒光），細(xì)胞胞膜 SSEA1 陽(yáng)性表達(dá)（紅色熒光），結(jié)果顯示 mESCs 仍處于未分化狀態(tài)，具有多能性，具備胚胎干細(xì)胞的特征。（圖 2）T4100um A-1 100um B-1100um C-1100um D-1

圖 1. mESCs 細(xì)胞培養(yǎng)光鏡圖（100×）Figure .1 ESCs cell culture.A. MESCs cells cultured in MEF feeding layer; B. MESCs cellscultured without MEF feeder layer; C. mESCs cell alkaline phosphataseAPstaining.2.1.2 SSEA1、OCT4 免疫熒光染色單克隆抗體 SSEA1 mouse mAb 加 anti-mouse IgG-CY3，OCT4 rabbit mAb 加anti-rabbit IgG-CY3 染色，可見(jiàn) mESCs 胞質(zhì)內(nèi) OCT4 陽(yáng)性表達(dá)（紅色熒光），細(xì)胞胞膜 SSEA1 陽(yáng)性表達(dá)（紅色熒光），結(jié)果顯示 mESCs 仍處于未分化狀態(tài)，具有多能性，具備胚胎干細(xì)胞的特征。（圖 2）100um
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R77

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本文編號(hào)：2609245