【摘要】：目的體外模擬角膜上皮細胞生長微環(huán)境誘導(dǎo)人牙髓干細胞(Dental pulp stem cells,DPSCs),觀察其分化為角膜上皮樣細胞的能力,并初步研究DPSCs與豬來源脫細胞小腸黏膜下層(Small intestine submucosa,SIS)支架材料的生物相容性,探討DPSCs作為種子細胞用于組織工程角膜上皮構(gòu)建的可行性。方法改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)DPSCs,流式細胞術(shù)進行鑒定。將條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM)與基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Basic medium,BM)混合,配制成比例為10%、20%、30%、40%、60%、90%、100%CM的培養(yǎng)基,分別用于培養(yǎng)DPSCs。CCK-8法檢測細胞增殖活性,選用30%、60%、90%CM體外誘導(dǎo)DPSCs,BM培養(yǎng)的DPSCs設(shè)為對照組,免疫熒光法檢測角膜上皮細胞標記物細胞角蛋白3(Cytokeratin3,CK3)、細胞角蛋白 12(Cytokeratin12,CK12)的表達。制備無菌脫細胞SIS及其浸提液,采用脫細胞SIS浸提液培養(yǎng)DPSCs,并將無菌脫細胞SIS與DPSCs共培養(yǎng),CCK-8法檢測DPSCs的增殖活性,同時將DPSCs接種到脫細胞SIS表面,HE染色觀察DPSCs的生長情況。結(jié)果培養(yǎng)4天時,梭形細胞從牙髓組織周圍爬出;繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,細胞呈集落生長;培養(yǎng)至第9天,細胞呈放射狀生長;14天時,細胞呈現(xiàn)密集的螺旋狀生長;1:3正常傳代,繼續(xù)培養(yǎng),第2天時細胞密度達80%,呈典型的長梭形,傳代7次后,細胞形態(tài)穩(wěn)定,胞質(zhì)飽滿均勻,增殖能力強。牙髓細胞高表達間充質(zhì)干細胞表面標記物CD90(99.26%)、CD105(98.69%),幾乎不表達造血干細胞表面標記物CD34(1.19%)、CD45(0.99%)。誘導(dǎo)3天時,30%、60%、90%CM組細胞不表達CK3,60%和90%CM組細胞開始表達CK12;7天時,30%、60%、90%CM組細胞可見CK3、CK12的表達;11天和14天時,30%、60%、90%CM組細胞繼續(xù)表達CK3、CK12。誘導(dǎo)3、7、11、14天時,BM組細胞未見CK3、CK12表達。脫細胞SIS浸提液和脫細胞SIS對DPSCs增殖活性的影響,與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。DPSCs接種到脫細胞SIS表面后,HE染色可見細胞能夠在脫細胞SIS表面生長。結(jié)論1.DPSCs在條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下能夠分化為角膜上皮樣細胞;2.DPSCs與脫細胞SIS具有良好的生物相容性;3.DPSCs作為種子細胞用于組織工程角膜上皮的構(gòu)建具有可行性。
【圖文】：

圖２邋ＤＰＳＣｓ原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)逡逑Ａ．４天后細胞從組織周圍爬出（１０0ｘ）邋；邋Ｂ．４天后貼壁的單細胞（１０0ｘ）邋；邋Ｃ．７天逡逑后的細胞狀態(tài)（ｌ00ｘ）；邋Ｄ．９天后的細胞狀態(tài)（１０0ｘ）；邋Ｅ．１４天后的細胞狀態(tài)（１０0ｘ）；逡逑Ｆ．傳代后的細胞狀態(tài)（１０0ｘ）逡逑２６逡逑

圖１取材過程逡逑Ａ．完整拔除第三磨牙；Ｂ．浸泡于ＰＢＳ中的第三磨牙；Ｃ．取出的牙髓組織；Ｄ．消化逡逑后的牙髓組織逡逑：Ｅ邋’邋：，詹ｙ邋．”．冗二；逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R77

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本文編號：2596563