【摘要】：糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見嚴(yán)重并發(fā)癥之一,可引起眼底特異性改變,居24歲至65歲人群致盲性眼病首位。根據(jù)視網(wǎng)膜新生血管是否出現(xiàn),DR分為非增殖性(也稱單純型或背景型)糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR),一旦進入PDR階段,便會對視功能構(gòu)成嚴(yán)重威脅。研究顯示,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和Roundabout homolog 4(Robo4)是DR發(fā)生發(fā)展過程中兩個重要調(diào)控因子,VEGF可以改變視網(wǎng)膜細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用,導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增高、血栓形成以及新生血管形成,引起視網(wǎng)膜滲出、出血、水腫,加速DR發(fā)生;Robo4在血管新生活躍區(qū)域附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增加,在正常生理條件下可以通過抑制VEGF信號通路維持血管內(nèi)平衡,在高糖條件下,VEGF與Robo4的表達(dá)水平同時上調(diào),相互協(xié)同促進DR的發(fā)生發(fā)展。因此,研究VEGF和Robo4的信號通路及調(diào)控機制對有效控制DR的發(fā)生發(fā)展尤其關(guān)鍵。在本課題中,我們首先探討了VEGF和Robo4在DR患者的纖維血管膜(fibrovascular membrane,FVM)中以及在鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜中表達(dá)的情況,預(yù)測兩者在DR發(fā)生發(fā)展過程中作用的相關(guān)性。本課題從人體組織標(biāo)本、細(xì)胞、動物模型三個層面進行實驗驗證:(1)將13例PDR患者的纖維血管膜組織標(biāo)本作為研究對象,通過HE染色分析PDR患者纖維血管膜的組織結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示PDR發(fā)生伴隨著新生血管的形成,初期階段只有少量纖維組織生成,隨著病程進一步發(fā)展,新生血管和纖維組織不斷增多,進而形成纖維血管膜,后期血管發(fā)生退行,纖維組織大量生成;免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在纖維血管膜中VEGF和Robo4存在共定位的現(xiàn)象,提示在PDR的發(fā)生發(fā)展過程中,VEGF和Robo4共同發(fā)揮作用。(2)為了解VEGF和Robo4在DR發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞水平的表達(dá)情況,在高糖條件下培養(yǎng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,利用RT-PCR和Western-Blot法檢測高糖條件下VEGF和Robo4的miRNA在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)情況。結(jié)果表明,高糖促進VEGF在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá),抑制Robo4在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。(3)為了在動物模型中檢測VEGF和Robo4在DR發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)情況,本實驗利用STZ誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型,采用Western-Blot法檢測糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF和Robo4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明,糖尿病大鼠飼養(yǎng)4-8周后,視網(wǎng)膜VEGF和Robo4蛋白表達(dá)均較正常對照組增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上研究提示,在DR發(fā)生發(fā)展過程中VEGF和Robo4相互作用:(1)在正常生理下,Robo4抑制VEGF的表達(dá),進而抑制DR的發(fā)生發(fā)展;(2)在高糖條件下,Robo4表達(dá)降低,對VEGF的抑制作用減弱,導(dǎo)致VEGF表達(dá)增加,進而促進視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展;(3)在視網(wǎng)膜病變過程中,Robo4和VEGF表達(dá)增加,協(xié)同加速病變進程。miRNA以多種方式參與DR進展:(1)直接與基因啟動子區(qū)域結(jié)合;(2)結(jié)合到靶基因的3'-非翻譯區(qū),引起轉(zhuǎn)錄后沉默、翻譯抑制或RNA降解;(3)與轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄結(jié)合導(dǎo)致染色質(zhì)的表觀遺傳修飾。研究miRNA在PDR患者中的表達(dá)水平,對于篩選靶向miRNA治療PDR至關(guān)重要。因此,我們分析了視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞miRNA在高糖條件下的表達(dá)情況,篩選同時與VEGF和Robo4相互作用的miRNA,在糖尿病大鼠模型中探討miRNA用于治療DR的可能性。(1)體外模擬DR高糖環(huán)境,培養(yǎng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,利用RT-PCR研究視網(wǎng)膜細(xì)胞在高糖條件下miRNA-15家族表達(dá)情況。結(jié)果表明,在高糖條件下,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中miRNA-15a、miRNA-16、miRNA-424表達(dá)水平均降低,miRNA-195和miRNA-497表達(dá)水平均升高。(2)利用軟件預(yù)測miRNA-15家族中的miRNA-15a和miRNA-195可以同時作用于VEGF和Robo4。選取miRNA-15a作為研究對象,驗證其對VEGF和Robo4的靶向作用,并將miRNA-15a agomir注射到STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠玻璃體內(nèi),Western-Blot檢測VEGF和Robo4蛋白表達(dá)情況。實驗結(jié)果表明,miRNA-15a靶向結(jié)合VEGF和Robo4,在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi),miRNA-15a agomir同時抑制VEGF和Robo4的表達(dá),miRNA-15a可以作為治療PDR的研究靶點。綜上所述,我們得出結(jié)論,VEGF和Robo4在促進PDR病程發(fā)展過程中均起到推動作用,進一步篩選的在糖尿病視網(wǎng)膜病變過程中參與調(diào)控VEGF與Robo4的miRNA,具有作為DR生物治療靶點的可能性。本課題的研究結(jié)果不僅有助于對DR進展機制的理解,而且為鑒定DR患者潛在有效的生物治療靶點提供理論支持,并推動miRNA成為生物治療靶點的研發(fā)及臨床應(yīng)用。
【圖文】：

糖尿病視網(wǎng)膜病變機理模式圖

VEGF等在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用機制模式圖
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 李東豪;胡利;何文智;丘紅紅;聞毅頤;楊倩;;中國人VEGF基因多態(tài)性與DR的關(guān)系[J];國際眼科雜志;2013年06期

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本文編號：2595651