【摘要】：目的干眼是臨床中較為常見的炎癥性和自發(fā)性免疫眼表疾病。由于干眼致病因素及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,臨床中尚無針對病因的有效治療藥物。近年來促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的抗炎和促進(jìn)炎癥消散的作用已得到廣泛認(rèn)同,并開始應(yīng)用于臨床中炎性疾病的治療,但其對于干眼的治療效果至今尚無充分的動物實驗證據(jù)及相關(guān)機(jī)制探討。因此,本實驗在首先建立淚液蒸發(fā)過強(qiáng)合并分泌不足型干眼鼠模型的基礎(chǔ)上,研究干眼病中眼瞼及結(jié)膜組織內(nèi)促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的變化特點(diǎn)及其性別特異性差異,同時對消退素D1在實驗性干眼愈合階段對眼表病變的影響及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析和研究。方法1.干眼鼠模型的建立及其有效性評價選取實驗動物6-8周齡C57BL/6雌鼠20只。隨機(jī)分為4組,其中3組分別建立3、5及10天干眼鼠模型,另一組設(shè)為正常對照。溫度、濕度和風(fēng)速分別控制在24-28℃、30%-35%和15L/min,用以模擬干燥環(huán)境。同時小鼠皮下注射氫溴酸東莨菪堿(1mg/100μl)以減少其自身淚液分泌。對照組小鼠置于正常環(huán)境中(溫度24-28℃、濕度40%-50%,無氣流),無任何藥物干預(yù)。角膜上皮熒光染色評分,淚液分泌量及結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度等為有效性評價指標(biāo)。2.干眼對于眼瞼組織中脂質(zhì)介質(zhì)的影響及其性別差異性的研究在第一部分研究基礎(chǔ)上,建立鼠干眼模型。選取雌雄小鼠各15只,隨機(jī)分為正常對照組、造模5天組和10天組。使用LC-MS/MS系統(tǒng)對樣本進(jìn)行脂質(zhì)分析。利用髓過氧化酶(MPO)活性實驗,流式細(xì)胞術(shù),實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)及組織學(xué)觀察等手段研究干眼對組織中細(xì)胞及分子水平的影響。3.消退素rvd1在實驗性干眼愈合階段對眼表病變的影響及調(diào)控作用選取實驗動物6-8周齡c57bl/6雌鼠20只,隨機(jī)分為正常對照組,干眼造模10天組,rvd1干預(yù)愈合組,及愈合對照組。其中兩個愈合組的小鼠在經(jīng)過10天造模處理后,放回正常環(huán)境中,并分別在5天愈合期內(nèi)給予rvd1或安慰劑利用mpo活性實驗和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測pmn和cd4+t細(xì)胞在淚腺組織中的含量。結(jié)果1.在實驗動物眼,小鼠角膜上皮熒光染色評分中,造模5天組與正常對照組相比,從(0.8±0.49)分上升至(6.35±0.03)分,具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。淚液分泌量在造模3天、5天和10天組中與對照組相比均有顯著性下降。組織學(xué)切片顯現(xiàn)上瞼、穹窿結(jié)膜杯狀細(xì)胞在造模組內(nèi)數(shù)量減少,且胞漿較小。對照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度為(26.92±1.10)個/100μm,造模10天組僅為(17.73±1.65)個/100μm,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。2.正常雌雄小鼠的眼瞼及結(jié)膜組織中檢測到促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的表達(dá)。其中,dha,17-hdha及l(fā)xa4在雌鼠眼瞼中的含量明顯高于雄鼠(p0.0232)。與正常對照組相比,雌鼠在造模5天后,其結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比對照組下降(35.34±0.06)%,而雄鼠造模5天時結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度比其對照組下降(51.09±0.02)%。同時,催化促炎性脂質(zhì)介質(zhì)合成的環(huán)氧化酶cox-2mrna在雌雄干眼模型鼠的眼瞼中相對表達(dá)量比正常對照組分別增加了(17.20±3.57)倍和(14.9±2.22)倍,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.003)。在干眼影響下,花生四烯酸(aa)源性促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)(lxa4)在雄鼠眼瞼中的表達(dá)量明顯高于雌鼠(p=0.02),而ω-3多不飽和脂肪酸源性促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)(dha、4-hdha、17-hdha)在干眼雌鼠中的含量多于雄鼠(p0.02)。細(xì)胞學(xué)分析顯示,雌鼠結(jié)膜中被cd45和ly6g抗體共同標(biāo)記的pmn數(shù)量較正常對照組高3倍(n=5)。而在雄鼠中,結(jié)膜中pmn數(shù)量在對照組中為1.91%,而在造模第5天時下降到0.48%,較正常組減少了75%(n=5)。3.rvd1干預(yù)愈合組及愈合對照組小鼠的淚液分泌量在愈合期逐漸升高,并于愈合期第5天恢復(fù)至正常水平。愈合期第1天,RvD1干預(yù)組的淚液分泌量為(1.42±0.23)mm,而愈合對照組為(1.04±0.22)mm,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.02)。此外,RvD1干預(yù)組中CD4+T細(xì)胞在淚腺中的數(shù)量為4.9%,在干眼造模10天組和愈合對照組中分別為16.2%和19.5%。RvD1干預(yù)愈合組中結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度以及淚腺組織中PMN數(shù)量與愈合對照組相比均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論1.研究中建立的小鼠模型具有干眼病的特征性眼表病理變化,對于干眼病的實驗性研究具有一定價值。2.本研究首次揭示了正常眼瞼及結(jié)膜組織中有促炎癥消退性脂質(zhì)介質(zhì)的表達(dá)。干眼引起眼瞼組織的炎性病變及促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的變化與結(jié)膜中的變化特征不同,說明二者可能存在各自獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制。另外,在眼瞼及結(jié)膜組織中,干眼對于促炎癥消退脂質(zhì)介質(zhì)的影響和調(diào)節(jié)具有性別特異性。3.RvD1對于干眼病組織中的炎性免疫細(xì)胞有潛在的調(diào)節(jié)作用,并可促進(jìn)干眼愈合早期的淚液分泌。
【圖文】：

圖 1 部分由 AA、EPA 和 DHA 合成的脂質(zhì)介質(zhì)的合成過程及其作用（引自 Serhan andPetasis 2011）2.1 ω-6 多不飽和脂肪酸源性抗炎促消退脂質(zhì)介質(zhì) LXA4在眼組織炎癥中的調(diào)控作用ω-6 多不飽和脂肪酸 AA 在不同的特定細(xì)胞內(nèi)被三大酶家族代謝，并產(chǎn)生LXs 等類花生酸（eicosanoids）。這三大酶家族包括環(huán)氧化酶（cyclooxygenases,COXs），脂肪氧化酶（lipoxygenases, LOXs）和細(xì)胞色素 P450（cytochrome P450s,CYP450s），在眼組織中均有功能性表達(dá)。其 G 蛋白偶聯(lián)受體供 LXs 等類花生酸結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。除 ω-6 AA 外，DHA、EPA 等 ω-3PUFA 同樣受到這些酶的催化。LXs 是第一個被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、促炎癥消退作用的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)[26]。它主要形成于急性炎癥的消退階段，在中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，，PMN）與血小板、內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞相互作用時，由 AA 在 LOX 酶的生物催化下產(chǎn)[27,28]

圖 2 LC/MS/MS 系統(tǒng)液質(zhì)聯(lián)用儀（源自 Gronert 實驗室 美國加州大學(xué)伯克利分校）本課題包括以下三部分：第一部分：干眼鼠模型的建立及其有效性評價第二部分：干眼對于眼瞼組織中脂質(zhì)介質(zhì)的影響及其性別差異性的研究第三部分：消退素 RvD1在實驗性干眼愈合階段對眼表病變的影響及調(diào)控作用
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R777.34

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙宇亮;楊濟(jì)橋;張凌;付平;;新型抗炎介質(zhì)消退素與腎臟疾病[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2013年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 胡逸萍;ROS-ERK-PGE_2信號通路調(diào)節(jié)皮膚損傷后早期炎癥反應(yīng)[D];暨南大學(xué);2014年

本文編號：2572185