發(fā)布時(shí)間：2019-09-18 00:05

【摘要】：目的：本研究選用鼻咽癌干細(xì)胞SP18細(xì)胞為對(duì)象，觀察LMP1羧基末端第三個(gè)功能活性區(qū)（CTAR3）對(duì)SP18細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響，，探討LMP1-CTAR3影響SP18細(xì)胞遷移與侵襲的分子機(jī)制。 方法：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)LMP1及其突變體LMP1△252-351的SP18細(xì)胞系SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351；采用MTT法、平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；選用劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲情況；利用基因芯片檢測(cè)SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351間的差異表達(dá)基因，使用生物信息學(xué)初步分析相關(guān)差異表達(dá)基因的功能。 結(jié)果： 1.LMP1-CTAR3對(duì)鼻咽癌干細(xì)胞SP18增殖、遷移與侵襲的影響 MTT生長曲線、平皿克隆結(jié)果顯示，SP18-LMP1細(xì)胞和SP18-LMP1△252-351細(xì)胞生長速度及克隆形成力明顯高于SP18細(xì)胞(空白對(duì)照)和SP18-LNSX細(xì)胞（載體對(duì)照）（P0.05），SP18-LMP1細(xì)胞生長速度及克隆形成力高于SP18-LMP1△252-351細(xì)胞（P0.05）。結(jié)果提示CTAR3在LMP1促進(jìn)SP18細(xì)胞增殖的過程中可能發(fā)揮一定的作用。 劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP18-LMP1細(xì)胞和SP18-LMP1△252-351細(xì)胞的遷移侵襲能力較SP18細(xì)胞和SP18-PLNSX細(xì)胞增強(qiáng)（P0.05），SP18-LMP1△252-351細(xì)胞較SP18-LMP1細(xì)胞降低（P0.05）。上述結(jié)果說明LMP1具有促進(jìn)SP18細(xì)胞遷移侵襲的能力，其中CTAR3可能發(fā)揮重要的作用。 2.LMP1-CTAR3影響細(xì)胞遷移與侵襲的差異基因篩選 采用Agilent4×44K人類全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)，篩選出差異表達(dá)基因314個(gè)，其中上調(diào)基因180個(gè)，下調(diào)基因134個(gè)。將314個(gè)差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能進(jìn)行“FunctionalAnnotationClustering”分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚成24個(gè)集合，選取EnrichmentScore分?jǐn)?shù)最高的3個(gè)功能集合，主要參與細(xì)胞凋亡、遷移運(yùn)動(dòng)相關(guān)的生物學(xué)過程。提示LMP1-CTAR3極大可能與SP18細(xì)胞的遷移密切相關(guān)。 采用DAVID在線分析軟件，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GeneOntology分類后，共篩選出18個(gè)與遷移及侵襲相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中13個(gè)上調(diào)基因，5個(gè)下調(diào)基因。 綜合信號(hào)通路、基因生物學(xué)分類、基因間相互作用分析，本研究篩選出EFNB2、THBS1、FN1、MMP14等LMP1-CTAR3促進(jìn)鼻咽癌遷移侵襲的相關(guān)差異表達(dá)基因，它們可能通過促進(jìn)細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，促進(jìn)腫瘤血管生成，從而在鼻咽癌的遷移侵襲中發(fā)揮作用。 結(jié)論： 1、CTAR3是LMP1促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18遷移侵襲的重要功能活性區(qū)。 2、LMP1可能通過調(diào)節(jié)EFNB2、THBS1、FN1、MMP14等表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌的遷移侵襲。
【圖文】：

結(jié) 果建 立 穩(wěn) 定 表 達(dá) L M P 1 及 其 突 變 體 L MP 1△25 2 -3 5 1 的 SP 1 8 細(xì) 胞 系將 空 白 質(zhì) 粒 、 PL N S X - LM P1 和 PL N S X- LM P1 △2 5 2- 3 51 分 別 轉(zhuǎn) 染 到 鼻 咽 癌 干 8， 用 G4 18 篩 選 1 -2 周 后， 可獲 得 穩(wěn)定 克 隆 （ 圖 1） 。將 細(xì) 胞分 SP 1 8 細(xì) 胞 照 ）、 S P 1 8- LN S X 細(xì) 胞（ 載 體對(duì) 照 ）、 S P 1 8 - LM P1 細(xì) 胞 和 SP 1 8 - LM P1 △2 52 -3 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 結(jié) 果 （ 圖 2 ） 顯 示 ， SP 1 8 細(xì) 胞 和 SP 1 8 - LN S X 細(xì) 胞 LM P1 表 SP 1 8 - LM P1 細(xì) 胞 和 SP 1 8- LM P1 △2 52 -3 51 細(xì) 胞 LM P1 表 達(dá) 陽 性 ； 分 別 抽 提 細(xì)A ，R T - PC R 瓊 脂糖 凝 膠電 泳 結(jié)果 （ 圖 3 ）顯 示 ，S P 1 8 細(xì) 胞和 SP 1 8 - LN S X 細(xì)形 成 ，而 SP 1 8 - LM P1 細(xì)胞 和 SP 1 8 - LM P1 △2 5 2- 3 51 細(xì)胞 均在 57 5 b p 處有 條 帶形 穩(wěn) 定 表達(dá) LM P1 及 其突 變 體 LM P1 △2 52 -3 51 的 SP 1 8 細(xì) 胞系 建 立 成功 。

2 免 疫細(xì) 胞化 學(xué) 染色 檢測(cè) LM P1 及 LM P1 △2 5 2- 3 51 在 SP 1 8 細(xì) 胞中 的 表 達(dá)（ ×4 0 ： S P 1 8 細(xì)胞 ， B ：S P 1 8 -L N S X 細(xì) 胞， C ：S P 1 8 -L M P1 細(xì)胞 ，D ： SP 1 8 -L M P1 △2 5 2- 3 5 1細(xì)胞 圖 3 RT - PC R 檢 測(cè) SP 1 8 細(xì) 胞中 LM P1 及 LM P1 △2 52 -3 51 的 表達(dá) ma r k e r2 00 0， 1： SP 1 8 細(xì) 胞， 2 ：SP 1 8 -L N S X 細(xì)胞 ，3 ：SP 1 8 -L M P1 細(xì)胞 ， 4 ：SP 1 8 -L M P1 △2 5 2- 3細(xì)胞 M 1 2 3 420 0 0 10 0 0 75 0 50 0 25 0 10 0 57 5
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2537163