【摘要】：Waardenburg綜合癥(Waardenburg syndrome,WS)是最常見的常染色體顯性遺傳性綜合征型耳聾,根據(jù)臨床特征分為4型(WS1-4)。由于表型的不全外顯,基因型和表型之間無固定內(nèi)在因果模式。中國人群WS的相關研究以基因組水平研究為主,主要限于小樣本的家系調(diào)查和相關基因突變檢測,MITF、PAX3和SOX10是主要的致病基因。在前期的研究中,我們對中南地區(qū)22例WS患者進行了臨床診斷和分型(其中家系4個共9例,散發(fā)13例),WSl型5例,WS2型15例,WS4型2例。檢測共發(fā)現(xiàn)9個新發(fā)雜合突變,致WS1的MITF基因突變T192fs和R217I；致WS1的PAX3基因突變H80D和H186fs；致WS2的SOX10基因突變G37fs, G38fs, R43X和E248fs；致WS4的SOX10基因突變W85X。這些基因突變導致WS的分子機制還不清楚。 為進一步研究中國人群WS患者發(fā)病的分子機制,我們利用這9個新發(fā)突變對致病基因MITF、PAX3和SOX10的功能進行相關的一系列體外實驗研究,包括突變基因真核細胞表達載體構建、Westernblot檢測蛋白表達、熒光素酶檢測蛋白活性、細胞免疫熒光觀察亞細胞定位、免疫共沉淀檢測蛋白相互作用及蛋白質DNA結合等,在轉錄和轉錄后水平研究突變蛋白功能改變及其對野生蛋白功能的影響。 結果發(fā)現(xiàn)9個基因突變產(chǎn)生的突變蛋白功能均發(fā)生了改變。野生型和突變體真核細胞表達載體在293FT細胞內(nèi)均能正確表達。熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)除R217I MITF和H80D PAX3有部分殘余功能外,其他突變體均失去功能,不能激活靶基因的轉錄活性。除E248fs SOX10具有顯性負性效應外,其余8個突變體均不能影響其相應的野生型蛋白的正常功能。在NIH3T3細胞中的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)R217I MITF、H80D PAX3和E248fs SOX10與野生型蛋白亞細胞定位一致定位于細胞核內(nèi),其余突變體出現(xiàn)異常的亞細胞定位,細胞核與細胞質均有分布,其中H186fs PAX3、G38fs SOX10以細胞核分布為主,T192fs MITF和SOX10的突變體G37fs、R43X、W85X以細胞質分布為主。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)H80D PAX3和H186fs PAX3均與野生型SOX10蛋白有相互作用,但二者失去與野生型SOX10蛋白的協(xié)同激活作用,不能協(xié)同上調(diào)MITF表達；5個SOX10突變體均不能與野生型PAX3產(chǎn)生協(xié)同效應而上調(diào)MITF表達水平,除E248fs SOX10外,其余4個SOX10突變蛋白均不能與野生型PAX3蛋白有相互作用。蛋白質與DNA結合實驗發(fā)現(xiàn)E248fs SOX10與DNA產(chǎn)生結合,進一步支持其顯性負性效應作用,但其半衰期變短,與野生型SOX10蛋白相比降解加快。 本研究得出以下結論： (1) R217I MITF盡管與野生型MITF蛋白亞細胞定位相同并存有部分功能,但其劑量不足以達到野生型MITF蛋白行使正常生理功能所需水平。T192fs MITF無功能與其功能域bHLH-Zip的缺失及異常的亞細胞定位相關。這兩個MITF突變蛋白通過下調(diào)酪氨酸酶基因表達。 (2)盡管H80D PAX3的突變位于PD域內(nèi),但由于保留有完整的HD域而存有部分功能,并與野生型PAX3蛋白亞細胞定位相同；HD功能域的缺失和異常的亞細胞定位導致H186fs PAX3功能喪失。這2個PAX3突變蛋白失去與野生型SOX10的協(xié)同作用而下調(diào)MITF基因表達。 (3) G37fs、G38fs、R43X和W85X產(chǎn)生的SOX10截斷蛋白缺失所有功能域而導致功能喪失,失去單獨或與野生型PAX3協(xié)同激活上調(diào)MITF基因表達作用。E248fs產(chǎn)生的截斷蛋白保留有HMG功能域可與DNA結合而產(chǎn)生顯性負性效應抑制野生型SOX10蛋白功能,但由于其降解較野生型SOX10加快,仍表現(xiàn)為功能喪失。本文首次對SOX10基因突變致WS2發(fā)病的分子機制進行了初步研究。 (4)本研究中9個雜合基因突變產(chǎn)生的突變蛋白的功能與其功能結構域關系密切,導致WS的發(fā)病機理主要是單倍體劑量不足效應。突變蛋白劑量不足以達到野生型蛋白行使正常生理功能的最低閾值而實現(xiàn)黑素細胞完全發(fā)育。MITF基因突變通過下調(diào)酪氨酸酶轉錄水平、PAX3和SOX10基因突變通過直接下調(diào)MITF轉錄水平而影響黑素細胞發(fā)育并造成黑色素的合成、轉運和分布障礙,導致虹膜、皮膚、內(nèi)耳黑色素缺如而引起WS表型。 (5)本研究在體外實驗從分子、細胞水平較全面的揭示與闡述了中國人群WS的發(fā)病機制,建立了較為完善的WS致病基因功能檢測的實驗系統(tǒng),為在動物水平體內(nèi)試驗進一步研究WS發(fā)病機制奠定了實驗理論和基礎。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R764

【共引文獻】

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1 Adam S Wallace;Richard B Anderson;;Genetic interactions and modifi er genes in Hirschsprung's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年45期

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1 張康軍;Semaphorin 5A在先天性巨結腸癥中的表達[D];遵義醫(yī)學院;2012年

2 臧冬東;RET基因多態(tài)性與先天性巨結腸患病風險研究[D];遵義醫(yī)學院;2012年

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本文編號：2536961