【摘要】：Waardenburg綜合癥(Waardenburg syndrome,WS)是最常見的常染色體顯性遺傳性綜合征型耳聾,根據(jù)臨床特征分為4型(WS1-4)。由于表型的不全外顯,基因型和表型之間無固定內(nèi)在因果模式。中國人群WS的相關(guān)研究以基因組水平研究為主,主要限于小樣本的家系調(diào)查和相關(guān)基因突變檢測,MITF、PAX3和SOX10是主要的致病基因。在前期的研究中,我們對中南地區(qū)22例WS患者進(jìn)行了臨床診斷和分型(其中家系4個(gè)共9例,散發(fā)13例),WSl型5例,WS2型15例,WS4型2例。檢測共發(fā)現(xiàn)9個(gè)新發(fā)雜合突變,致WS1的MITF基因突變T192fs和R217I；致WS1的PAX3基因突變H80D和H186fs；致WS2的SOX10基因突變G37fs, G38fs, R43X和E248fs；致WS4的SOX10基因突變W85X。這些基因突變導(dǎo)致WS的分子機(jī)制還不清楚。 為進(jìn)一步研究中國人群WS患者發(fā)病的分子機(jī)制,我們利用這9個(gè)新發(fā)突變對致病基因MITF、PAX3和SOX10的功能進(jìn)行相關(guān)的一系列體外實(shí)驗(yàn)研究,包括突變基因真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建、Westernblot檢測蛋白表達(dá)、熒光素酶檢測蛋白活性、細(xì)胞免疫熒光觀察亞細(xì)胞定位、免疫共沉淀檢測蛋白相互作用及蛋白質(zhì)DNA結(jié)合等,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平研究突變蛋白功能改變及其對野生蛋白功能的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因突變產(chǎn)生的突變蛋白功能均發(fā)生了改變。野生型和突變體真核細(xì)胞表達(dá)載體在293FT細(xì)胞內(nèi)均能正確表達(dá)。熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)除R217I MITF和H80D PAX3有部分殘余功能外,其他突變體均失去功能,不能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。除E248fs SOX10具有顯性負(fù)性效應(yīng)外,其余8個(gè)突變體均不能影響其相應(yīng)的野生型蛋白的正常功能。在NIH3T3細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)R217I MITF、H80D PAX3和E248fs SOX10與野生型蛋白亞細(xì)胞定位一致定位于細(xì)胞核內(nèi),其余突變體出現(xiàn)異常的亞細(xì)胞定位,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布,其中H186fs PAX3、G38fs SOX10以細(xì)胞核分布為主,T192fs MITF和SOX10的突變體G37fs、R43X、W85X以細(xì)胞質(zhì)分布為主。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)H80D PAX3和H186fs PAX3均與野生型SOX10蛋白有相互作用,但二者失去與野生型SOX10蛋白的協(xié)同激活作用,不能協(xié)同上調(diào)MITF表達(dá)；5個(gè)SOX10突變體均不能與野生型PAX3產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)而上調(diào)MITF表達(dá)水平,除E248fs SOX10外,其余4個(gè)SOX10突變蛋白均不能與野生型PAX3蛋白有相互作用。蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E248fs SOX10與DNA產(chǎn)生結(jié)合,進(jìn)一步支持其顯性負(fù)性效應(yīng)作用,但其半衰期變短,與野生型SOX10蛋白相比降解加快。 本研究得出以下結(jié)論： (1) R217I MITF盡管與野生型MITF蛋白亞細(xì)胞定位相同并存有部分功能,但其劑量不足以達(dá)到野生型MITF蛋白行使正常生理功能所需水平。T192fs MITF無功能與其功能域bHLH-Zip的缺失及異常的亞細(xì)胞定位相關(guān)。這兩個(gè)MITF突變蛋白通過下調(diào)酪氨酸酶基因表達(dá)。 (2)盡管H80D PAX3的突變位于PD域內(nèi),但由于保留有完整的HD域而存有部分功能,并與野生型PAX3蛋白亞細(xì)胞定位相同；HD功能域的缺失和異常的亞細(xì)胞定位導(dǎo)致H186fs PAX3功能喪失。這2個(gè)PAX3突變蛋白失去與野生型SOX10的協(xié)同作用而下調(diào)MITF基因表達(dá)。 (3) G37fs、G38fs、R43X和W85X產(chǎn)生的SOX10截?cái)嗟鞍兹笔泄δ苡蚨鴮?dǎo)致功能喪失,失去單獨(dú)或與野生型PAX3協(xié)同激活上調(diào)MITF基因表達(dá)作用。E248fs產(chǎn)生的截?cái)嗟鞍妆Ａ粲蠬MG功能域可與DNA結(jié)合而產(chǎn)生顯性負(fù)性效應(yīng)抑制野生型SOX10蛋白功能,但由于其降解較野生型SOX10加快,仍表現(xiàn)為功能喪失。本文首次對SOX10基因突變致WS2發(fā)病的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 (4)本研究中9個(gè)雜合基因突變產(chǎn)生的突變蛋白的功能與其功能結(jié)構(gòu)域關(guān)系密切,導(dǎo)致WS的發(fā)病機(jī)理主要是單倍體劑量不足效應(yīng)。突變蛋白劑量不足以達(dá)到野生型蛋白行使正常生理功能的最低閾值而實(shí)現(xiàn)黑素細(xì)胞完全發(fā)育。MITF基因突變通過下調(diào)酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄水平、PAX3和SOX10基因突變通過直接下調(diào)MITF轉(zhuǎn)錄水平而影響黑素細(xì)胞發(fā)育并造成黑色素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分布障礙,導(dǎo)致虹膜、皮膚、內(nèi)耳黑色素缺如而引起WS表型。 (5)本研究在體外實(shí)驗(yàn)從分子、細(xì)胞水平較全面的揭示與闡述了中國人群WS的發(fā)病機(jī)制,建立了較為完善的WS致病基因功能檢測的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),為在動物水平體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步研究WS發(fā)病機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)理論和基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R764

【共引文獻(xiàn)】

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1 Adam S Wallace;Richard B Anderson;;Genetic interactions and modifi er genes in Hirschsprung's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2011年45期

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2 臧冬東;RET基因多態(tài)性與先天性巨結(jié)腸患病風(fēng)險(xiǎn)研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2012年

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本文編號：2536961