【摘要】：年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration,AMD)是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家以及我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)50歲以上老年人群視力喪失甚至失明的一種退行性疾病。疾病過(guò)程中涉及的主要結(jié)構(gòu)有感光細(xì)胞,視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium,RPE),Bruch 膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管(Choroidal Neovascularization,CNV)等。早期AMD主要表現(xiàn)為玻璃膜疣(drusen)和RPE色素異常,晚期AMD表現(xiàn)為RPE和光感受器地圖狀萎縮(Geographic Atrophy,GA)以及CNV形成。AMD的病因非常復(fù)雜,現(xiàn)認(rèn)為該病是由多種因素引起的綜合病征,可能與年齡、遺傳、種族、慢性光損傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏、吸煙等因素有關(guān),但其確切的病因尚不清楚。AMD損傷人視覺(jué)最重要、最敏銳的黃斑部,造成不可逆的視力喪失,導(dǎo)致許多老年人在退休年齡時(shí)失去獨(dú)立性,不僅影響患者的生活質(zhì)量,更給國(guó)家?guī)?lái)一系列的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。近年來(lái),抗氧化劑和礦物質(zhì)補(bǔ)充劑等藥物被用于預(yù)防AMD的發(fā)生或減緩干性AMD的進(jìn)展,但是療效并不十分理想;而對(duì)于濕性AMD,抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelium Growth Factor,VEGF)藥物治療可有效挽救部分患者的視力,然而反復(fù)注射會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及治療風(fēng)險(xiǎn),而且對(duì)部分患者的治療效果不佳。因此,尋找新的更安全有效的治療方法和治療靶點(diǎn)成為近年來(lái)眼科研究的重點(diǎn)課題之一。近幾年大量研究表明,組織因子(tissue factor,TF)可能參與AMD的發(fā)病機(jī)制,研究者認(rèn)為氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)可引起TF表達(dá)上調(diào),從而誘發(fā)AMD的發(fā)生。此外,有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示TF不僅參與腫瘤血管的形成,而且參與CNV的形成。組織因子靶向肽(Tissue Factor Targeting Peptide,TF-TP)是課題組成員饒教授合成的一種新型TF靶向性小分子多肽,本研究擬探討TF-TP對(duì)AMD可能的應(yīng)用價(jià)值。圍繞這一目的,我們開(kāi)展了兩方面的研究工作:第一部分探討TF-TP對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Human Retinal Pigment Epithelium,hRPE)損傷的作用及相關(guān)機(jī)制;第二部分觀察TF-TP對(duì)激光誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用。目的:1.探討TF-TP對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。2.觀察TF-TP對(duì)激光誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用。方法:1.首先用不同濃度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP 培養(yǎng)正常 hRPE細(xì)胞24h后,采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度TF-TP對(duì)正常hRPE細(xì)胞有無(wú)毒副作用。2.體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞分為3組,空白對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)條件下進(jìn)行處理;藍(lán)光照射組細(xì)胞用輻射強(qiáng)度為(4.0±0.5)mW/cm2的藍(lán)光照射12h建立藍(lán)光損傷細(xì)胞模型;TF-TP組細(xì)胞先分別用不同濃度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培養(yǎng)細(xì)胞24 h,再用藍(lán)光照射12h。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)TF-TP作用于藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞的最佳濃度。并將此最佳濃度用于后面實(shí)驗(yàn)的分組:空白對(duì)照組、藍(lán)光照射組和最佳濃度TF-TP組。3.分別在普通倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察各組hRPE細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化;采用Hoechst染色法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況;并用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中TF蛋白和相關(guān)凋亡蛋白bax和bc1-2的表達(dá)。4.采用Western blot法檢測(cè)不同藍(lán)光照射時(shí)間(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE細(xì)胞中TF蛋白的表達(dá)變化;5.利用532nm激光建立小鼠CNV模型,實(shí)驗(yàn)分組如下:正常對(duì)照組小鼠不做任何處理,激光組為單純激光誘導(dǎo)小鼠CNV形成,給藥組為激光后第一天即給予玻璃體腔注射TF-TP,隔天注射一次,共三次。并運(yùn)用眼底熒光血管造影(FFA)檢查評(píng)價(jià)各組小鼠CNV滲漏情況。6.采用組織病理學(xué)方法觀察激光后14天各組小鼠CNV中央最大厚度;采用免疫組化染色法測(cè)定視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織中CD34的表達(dá)量;7.運(yùn)用Western Blot法檢測(cè)小鼠RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合物中TF蛋白的表達(dá)情況。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究各檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布,以x±s表示。各檢測(cè)指標(biāo)的均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊。兩組測(cè)量指標(biāo)間的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組測(cè)量指標(biāo)間的總體差異比較均采用單因素方差分析(ANOVA),各組間多重比較均采用LSD-t檢驗(yàn)。P㩳0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.不同濃度TF-TP干預(yù)正常hRPE細(xì)胞24h后,各組間細(xì)胞存活率無(wú)明顯改變(F=2.15,P=0.11),提示TF-TP對(duì)hRPE細(xì)胞無(wú)毒副作用。2.空白對(duì)照組、藍(lán)光照射組和各濃度TF-TP組細(xì)胞存活率分別為(100.0±0.00)%、(43.79±6.55)%、(57.24±7.89)%、(59.97±4.73)%、(63.45±3.57)%、(58.88±5.59)%和(55.95±2.80)%。各組細(xì)胞存活率的總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.16,P=0.00),與藍(lán)光照射組相比,各濃度TF-TP組細(xì)胞存活率均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01、0.00、0.00、0.00、0.00)。150μmol/L TF-TP 組細(xì)胞的存活率最高,可作為構(gòu)建TF-TP保護(hù)模型,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.光學(xué)顯微鏡下和透射電子顯微鏡下顯示,藍(lán)光照射組有較多皺縮、變形、懸浮細(xì)胞,可見(jiàn)細(xì)胞微絨毛數(shù)量減少,部分線粒體嵴斷裂和缺失以及細(xì)胞空泡樣變性,而TF-TP組細(xì)胞異常形態(tài)的細(xì)胞較少,細(xì)胞絨毛結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞質(zhì)中空泡樣結(jié)構(gòu)改變和線粒體損傷改變明顯減輕�？瞻讓�(duì)照組、藍(lán)光照射組和150μmol/L TF-TP組細(xì)胞凋亡率分別為(0.98±0.19)%、(9.98±0.82)%和(5.73±0.88)%,組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F206.18,P=0.00),其中TF-TP組細(xì)胞凋亡率明顯低于藍(lán)光照射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,藍(lán)光照射組細(xì)胞中bax蛋白和TF蛋白的表達(dá)量明顯增加,bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);與藍(lán)光損傷組相比,TF-TP組細(xì)胞中bax蛋白和TF蛋白的表達(dá)量均明顯下降,而bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㩳0.05)。4.不同藍(lán)光照射時(shí)間(0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)后hRPE細(xì)胞中TF蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.25±0.01)、(0.26±0.02)、(0.28±0.02)、(0.31±0.02)、(0.60±0.03)、(0.79±0.04)和(0.56±0.03)。各組間 TF 蛋白的相對(duì)表達(dá)量總體間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=276.99,P㩳0.05),且TF蛋白在hRPE細(xì)胞中的表達(dá)隨著藍(lán)光照射時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,在藍(lán)光照射12h時(shí)達(dá)到高峰,隨后出現(xiàn)下降。5.正常對(duì)照組小鼠的FFA檢查顯示:小鼠視網(wǎng)膜血管充盈并以視盤為中心呈放射狀分布,脈絡(luò)膜血管表現(xiàn)為彌漫性背景熒光,無(wú)熒光素滲漏。激光組小鼠在光凝后14天,FFA檢查示:視網(wǎng)膜光斑處可見(jiàn)明顯熒光滲漏點(diǎn),造影晚期呈彌漫性熒光擴(kuò)散。TF-TP給藥組小鼠的FFA檢查顯示:視網(wǎng)膜光斑處可見(jiàn)輕度熒光滲漏,造影晚期可見(jiàn)滲漏和高熒光點(diǎn)但無(wú)明顯擴(kuò)散。激光組和TF-TP給藥組兩組間滲漏率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=0.59,P=0.24)。6.與激光組的CNV厚度(115.89±5.04um,n=6)相比,TF-TP給藥組的CNV厚度(60.02±2.48um,n=6)明顯減小,兩者間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=24.39,P0.05),提示TF-TP干預(yù)后可以顯著抑制CNV的厚度。免疫組化結(jié)果顯示:TF-TP給藥組的CD34免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物平均光密度值(0.09±0.03)與單純激光組(0.16±0.01)相比明顯減小,兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.93,P0.05)。7.Western Blot結(jié)果顯示:正常對(duì)照組、激光組、TF-TP給藥組的TF蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.14±0.01)、(0.40±0.02)、(0.22±0.03),經(jīng)過(guò)單因素方差分析可得,各組間TF蛋白的相對(duì)表達(dá)量總體間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=128.26,P0.05),各組間進(jìn)一步多重比較,TF-TP給藥組的TF蛋白相對(duì)表達(dá)量與激光組比較明顯降低,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:1.TF-TP能夠改善藍(lán)光誘導(dǎo)損傷的hRPE細(xì)胞結(jié)構(gòu),降低細(xì)胞凋亡率,減少細(xì)胞中TF蛋白和bax蛋白的表達(dá),增加bcl-2蛋白的表達(dá),減輕藍(lán)光誘導(dǎo)的hRPE細(xì)胞損傷。2.TF-TP可以減小激光誘導(dǎo)的小鼠CNV厚度,降低CD34的陽(yáng)性表達(dá),減少小鼠RPE脈絡(luò)膜混合物中TF蛋白的表達(dá),抑制小鼠CNV的形成。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R774.5

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本文編號(hào)：2533985