【摘要】：研究背景和目的視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration,RD),包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP),是一類以進行性光感受器丟失為特征的遺傳性眼病[1,2],是發(fā)達國家最常見的致盲性眼病之一,目前尚無有效治療手段。近期研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞活化介導的免疫炎癥反應[3-5]和Müller細胞的膠質(zhì)活化[6,7]是變性視網(wǎng)膜主要的微環(huán)境改變,對視網(wǎng)膜變性的進展發(fā)揮了關(guān)鍵作用,可望成為治療的靶點[8]。干細胞移植是目前治療RD等致盲性眼病最具前景的手段,植入細胞的營養(yǎng)效應和免疫調(diào)節(jié)作用被認為是干細胞在短期發(fā)揮治療作用的重要機制,而細胞替代效應(cell replacement)被認為是其長期作用的機制[9]。眾所周知,移植細胞的命運受其所在微環(huán)境的影響。近期研究發(fā)現(xiàn),抑制變性視網(wǎng)膜中的免疫炎癥反[10]應或Müller細胞活化產(chǎn)生的膠質(zhì)瘢痕[11],能夠提高移植細胞的存活及功能整合,有利于長期的細胞替代效應。肝臟X受體(liver X receptors,LXRs)是核受體超家族成員之一,在調(diào)節(jié)脂質(zhì)、葡萄糖代謝方面起重要作用[12,13]。近期研究報道LXRs對神經(jīng)退行性病變中的免疫炎癥反應同樣起重要調(diào)節(jié)作用[13],并與膠質(zhì)細胞活化密切相關(guān)[14]。Lei等發(fā)現(xiàn)LXRs受體激動劑T0901317能夠保護N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導的視網(wǎng)膜損傷以及抑制實驗性葡萄膜炎引起的眼部炎癥[15,16]。LXRs激活對變性視網(wǎng)膜有何作用,對變性視網(wǎng)膜的微環(huán)境有何影響,這種作用對植入的干細胞命運和治療效果有何影響,目前未見相關(guān)文獻報道。本研究主要探索LXRs受體激動劑T0901317介導的LXRs激活對視網(wǎng)膜變性小鼠模型Rd1視網(wǎng)膜中的Müller細胞的膠質(zhì)化和小膠質(zhì)細胞的免疫炎癥反應有何調(diào)節(jié)作用,這種作用能否延緩Rd1小鼠視網(wǎng)膜感光細胞的變性進程、挽救視功能及對植入的小鼠神經(jīng)干細胞C17.2的命運轉(zhuǎn)歸和治療效果有何影響。初步探討LXRs激活對變性微環(huán)境以及植入干細胞的作用及機制。方法:第一部分:LXRs激活對Rd1小鼠變性視網(wǎng)膜的影響1.取出生后7天(P7)Rd1小鼠,同天齡C57/BL6小鼠作為對照。連續(xù)7天給予LXRs激動劑T0901317或2%二甲亞楓(DMSO)腹腔注射,于P15取小鼠視網(wǎng)膜標本,運用RT-qPRC檢測視網(wǎng)膜中LXRs的激活情況。2.取P15小鼠視網(wǎng)膜標本,運用免疫組化以及Western-blot技術(shù),對比LXRs激活與否對小鼠視網(wǎng)膜中光感受細胞凋亡、Müller細胞膠質(zhì)化和小膠質(zhì)細胞激活的影響。3.運用視網(wǎng)膜電圖(ERG)技術(shù),檢測P15小鼠視網(wǎng)膜功能,觀察LXRs激活對RD1小鼠視網(wǎng)膜視功能的影響。第二部分:LXRs激活影響Rd1小鼠視網(wǎng)膜變性的機制1.取T090處理7天后P15的變性RD1小鼠視網(wǎng)膜RNA標本,RT-q PCR檢測LXRs激活后白介素6(IL-6)、環(huán)氧合酶2(COX-2)、一氧化氮合酶(i NOS)等炎癥相關(guān)基因表達的變化。2.基因芯片技術(shù)檢測T0介導LXRs激活后Rd1變性小鼠視網(wǎng)膜總RNA表達譜變化,RT-qPCR驗證相關(guān)結(jié)果。第三部分:LXRs激活對神經(jīng)干細胞生物學特性及在Rd1小鼠視網(wǎng)膜中的影響1.不同濃度的T0處理體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細胞系L2.3 48h后,觀察神經(jīng)干細胞形成克隆球的大小,并用流式細胞術(shù)檢測凋亡的情況。2.選取天齡為P11的Rd1小鼠,連續(xù)3天給予T0(50mg/kg)腹腔注射,于P14給予小鼠視玻璃體腔內(nèi)移植小鼠神經(jīng)干細胞系GFP-C17.2,1周后取小鼠視網(wǎng)膜標本,免疫組化觀察小鼠視網(wǎng)膜感光細胞、移植細胞的情況。3.ERG檢測移植后1周變性小鼠視功能,觀察聯(lián)合T0與干細胞移植后Rd1小鼠視功能改變情況。結(jié)果:第一部分:LXRs激活對Rd1小鼠變性視網(wǎng)膜的影響1.RT-PCR結(jié)果顯示腹腔連續(xù)注射T0,可以增加小鼠視網(wǎng)膜中的LXRβ以及LXRs下游基因ABCA1、ABCG1等表達,但LXRα表達降低,提示T0能夠且主要激活小鼠視網(wǎng)膜中LXRβ亞型。2.T0介導的LXRs激活可顯著抑制Müller細胞GFAP的表達以及顯著減少活化小膠質(zhì)細胞的數(shù)量,明顯減少Rd1小鼠視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡數(shù)量,延緩Rd1小鼠視網(wǎng)膜變性過程中光感受細胞的丟失,提示激活LXRs可通過抑制視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的活化而延緩變性。3.T0介導的LXRs激活可以部分挽救Rd1小鼠變性過程中視功能的損害,ERG表現(xiàn)為暗適應下b波幅值的顯著升高。第二部分:LXRs激活影響Rd1小鼠視網(wǎng)膜的機制1.RT-qPCR結(jié)果顯示,激活LXRs可顯著抑制多種炎癥相關(guān)基因如IL-6、COX-2、i NOS等的表達,提示LXRs參與了變性視網(wǎng)膜中炎癥反應的調(diào)控。2.表達譜基因芯片檢測結(jié)果提示LXRs激活可能通過JAK3-STAT途徑抑制變性視網(wǎng)膜中的Müller細胞膠質(zhì)化和小膠質(zhì)膠質(zhì)活化,改善變性視網(wǎng)膜的微環(huán)境從而延緩視網(wǎng)膜變性進程。第三部分:LXRs激活對神經(jīng)干細胞生物學特性及在Rd1小鼠視網(wǎng)膜中的影響1.LXRs激活能夠增加L2.3的增殖,對其凋亡沒有影響。2.移植入T0處理的Rd1小鼠玻璃體腔的神經(jīng)干細胞C17.2存活率較對照組高,且其視網(wǎng)膜外核層厚度厚于對照組。3.T0預處理聯(lián)合C17.2移植對天齡P21的Rd1小鼠視功能的未見明顯的保護作用。結(jié)論:1.T0通過激活Rd1小鼠變性視網(wǎng)膜中的LXRβ受體,進而調(diào)節(jié)JAK3-STAT信號通路而抑制Müller細胞、小膠質(zhì)細胞的過度活化所介導的膠質(zhì)化和免疫炎癥反應,從而減少Rd1小鼠視網(wǎng)膜中感光細胞的凋亡,挽救Rd1小鼠部分視功能。2.T0預處理能夠改善Rd1小鼠視網(wǎng)膜變性微環(huán)境,提高移植入Rd1小鼠視網(wǎng)膜的小鼠神經(jīng)干細胞C17.2的存活率。T0預處理與C17.2移植對Rd1小鼠視網(wǎng)膜外核層的保護具有協(xié)同作用。
【圖文】：

圖 2-1 小鼠給藥及標本取樣流程示意圖（3）RT-qPCR 檢測：通過 RT-qPCR 在 mRNA 水平檢測 Rd1 及 C57 小鼠視網(wǎng)膜經(jīng) T0901317 處α、LXRβ 以及其下游基因 ABCA1、ABCG1 表達的變化。1）配制 RT-qPCR 常用試劑① 50×電泳緩沖液 TAE：Tris 堿，242g；EDTA，，100ml（0.5mol/L PH＝8酸，57.1ml；以蒸餾水配至 1000ml；去離子水 50 稀釋使用。② 1‰ DEPC 水配制 75%乙醇，4℃?zhèn)溆谩?）提取視網(wǎng)膜總 RNA① 腹腔注射戊巴比妥鈉麻藥后斷頸處死小鼠，顯微鏡下提取小鼠視網(wǎng)膜，每 8 眼，置于冰上，加入 1ml Trizol 試劑，裂解 5min。② 加入 0.2ml 氯仿后振蕩混勻至肉眼不見視網(wǎng)膜組織；4℃，15000g，離心 5③ 提取上層水相 400μl，加入等體積異丙醇后混勻；4℃，15000g，離心 2

圖 2-2 T0 處理后 C57 和 Rd1 小鼠視網(wǎng)膜 LXRs 基因表達的變化經(jīng) T0 處理 7 天后 C57 小鼠視網(wǎng)膜 LXRα mRNA 表達水平幾乎無變化，LXRNA 表達水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義。Rd1 經(jīng) T0 處理后小鼠與對照組相比視網(wǎng)膜 LXRα 基因表達水平降低，LXRβ mRNA 表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)意義。（t 檢驗，*P＜0.05，n=6）表 2-3 經(jīng) T0 處理后小鼠視網(wǎng)膜 LXRs 靶基因表達水平統(tǒng)計數(shù)據(jù)ABCA1 ABCG1C57 對照組 1.00±0.00 1.00±0.00C57 處理組 6.98±0.08*** 2.85±0.26*Rd1 對照組 5.36±0.34 1.97±0.39Rd1 處理組 13.70±2.37** 3.23±0.20*
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774.1

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