【摘要】：目的：許多眼科疾病和外傷，如青光眼、視神經(jīng)缺血、頓挫傷、視神經(jīng)管骨折等，都可以使視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞（retinal ganglioncells, RGCs）不可逆性凋亡，最終導(dǎo)致視覺功能障礙。目前對于此類疾患仍無有效的治療方法。視神經(jīng)和視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）在顱外的延伸，在動物手術(shù)位置上具有優(yōu)越性，因而視神經(jīng)損傷模型又常被用來模擬CNS的損傷。因此，本研究從組織工程的角度，構(gòu)建大鼠羊膜上皮細(xì)胞(amniotic epithelial cells, AECs)與膠原海綿復(fù)合體，將其移入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，探討其對損傷視神經(jīng)及CNS的作用。 方法： 1)取妊娠晚期的SD大鼠，用胰蛋白酶序貫消化法獲得原代AECs，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測AECs是否表達(dá)CK19、COX10及Nestin，用PKH26標(biāo)記第3代AECs。 2)構(gòu)建AECs與膠原海綿復(fù)合體，在熒光顯微鏡下觀察復(fù)合體內(nèi)AECs的存活。 3)將SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、單純損傷組、空支架組和復(fù)合體組。單純損傷組：在左眼視乳頭后約2mm處用1mm注射器針頭切開視神經(jīng)外膜，完全吸除長約0.5mm的視神經(jīng)，保持神經(jīng)外膜的主要血管不受損傷；空支架組：在視神經(jīng)的吸斷處移植相應(yīng)大小的膠原海綿；復(fù)合體組：在視神經(jīng)的吸斷處注入10μl密度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液后，移植相應(yīng)大小的復(fù)合體。 4)觀察膠原海綿和復(fù)合體與視神經(jīng)的組織相容性。術(shù)后第7天計(jì)數(shù)復(fù)合體內(nèi)的AECs并檢測其Nestin的表達(dá)。術(shù)后第28天，觀察AECs與再生軸突的關(guān)系。 5)檢測復(fù)合體移植對RGCs的作用：HE染色、尼氏染色、CTB-FITC順行示蹤和免疫組織化學(xué)法檢測MAP-2在視網(wǎng)膜中的表達(dá)。 6)檢測復(fù)合體移植對視神經(jīng)的作用：HE染色、CTB-FITC順行示蹤和免疫組織化學(xué)法檢測GFAP、GAP-43在視神經(jīng)中的表達(dá)。 7)用Panorama Maker5軟件拼接圖片，用Photoshop CS3軟件計(jì)數(shù)和測量長度，用Image Pro Plus6.0軟件測量面積，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1)體外培養(yǎng)的AECs可以表達(dá)CK19、COX10和Nestin，AECs具有干細(xì)胞特性和向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能。 2)復(fù)合體內(nèi)的AECs生物活性好，細(xì)胞密度為604.3個(gè)/mm2，48%的AECs表達(dá)Nestin，復(fù)合體內(nèi)部分細(xì)胞仍具有向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能。 3)術(shù)后第28天至第56天，視神經(jīng)內(nèi)基本不見膠原海綿的空間物理結(jié)構(gòu)，膠原海綿和復(fù)合體與視神經(jīng)的組織相容性好。術(shù)后7天復(fù)合體內(nèi)存活的AECs密度為424.7個(gè)/mm2，17%的AECs表達(dá)Nestin。復(fù)合體內(nèi)的AECs至少到第28天還有存活，并可向損傷區(qū)兩側(cè)遷移。復(fù)合體內(nèi)的AECs與再生軸突伴行。復(fù)合體內(nèi)AECs存活率較高，部分AECs具有向神經(jīng)類細(xì)胞分化的潛能，復(fù)合體利于改善視神經(jīng)再生的微環(huán)境。 4)視網(wǎng)膜的尼氏染色顯示：術(shù)后第28天，空支架組節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞直徑≥12μm的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞總數(shù)多于單純損傷組，復(fù)合體組又多于空支架組；細(xì)胞直徑＜12μm的細(xì)胞數(shù)量，空支架組和復(fù)合體組多于單純損傷組。復(fù)合體可增加視網(wǎng)膜內(nèi)各類細(xì)胞的數(shù)量，特別是大細(xì)胞；膠原海綿的作用相對較小。 5）視網(wǎng)膜的HE染色顯示：術(shù)后第28天和第56天，各實(shí)驗(yàn)組的節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)、內(nèi)網(wǎng)層厚度和內(nèi)核層厚度均比正常組少。節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)，術(shù)后第28天復(fù)合體組多于單純損傷組和空支架組，術(shù)后第56天復(fù)合體組多于空支架組；內(nèi)網(wǎng)層厚度和內(nèi)核層厚度，術(shù)后第56天復(fù)合體組和空支架組均高于單純損傷組。復(fù)合體比膠原海綿對節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)、內(nèi)網(wǎng)層和內(nèi)核層的增加作用更明顯。 6）CTB-FITC示蹤的RGCs胞體及其視網(wǎng)膜內(nèi)軸突顯示：術(shù)后第28天和第56天，各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜中央、中間和外周的CTB-FITC陽性區(qū)域面積比例均低于正常組。中央：術(shù)后第28天復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低；術(shù)后第56天復(fù)合體組和空支架組均高于單純損傷組。中間：術(shù)后第28天各實(shí)驗(yàn)組無明顯差異，術(shù)后第56天復(fù)合體組高于空支架組和單純損傷組。外周：術(shù)后第28天各實(shí)驗(yàn)組無明顯差異；術(shù)后第56天復(fù)合體組高于單純損傷組。復(fù)合體和膠原海綿可增加視網(wǎng)膜內(nèi)存活的RGCs及其軸突，前者效果更為顯著。 7）CTB-FITC示蹤的視神經(jīng)顯示：術(shù)后第28天和第56天，近側(cè)段和損傷區(qū)的CTB-FITC陽性區(qū)域面積比例，復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低。復(fù)合體比膠原海綿更能增加再生軸突的數(shù)量，復(fù)合體移植后可促進(jìn)再生的軸突穿過損傷區(qū)到遠(yuǎn)側(cè)段815μm處。 8）免疫組織化學(xué)染色顯示：術(shù)后第28天，各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜每個(gè)視野內(nèi)MAP-2陽性物質(zhì)積分光密度均低于正常組，復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低，復(fù)合體增加視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元存活的作用強(qiáng)于膠原海綿。術(shù)后第28天和第56天損傷區(qū)GFAP陽性物質(zhì)平均積分光密度，單純損傷組復(fù)合體組最高，空支架組次之，復(fù)合體組最低，復(fù)合體使損傷區(qū)GFAP表達(dá)減少的作用大于膠原海綿。術(shù)后第28天組損傷區(qū)GAP-43陽性物質(zhì)平均積分光密度，復(fù)合體組最高，空支架組次之，單純損傷組最低，復(fù)合體使損傷區(qū)GAP-43表達(dá)增加的作用大于膠原海綿。 結(jié)論： 1)膠原海綿的空間物理結(jié)構(gòu)有利于AECs粘附和生存。 2) AECs膠原海綿復(fù)合體移植可發(fā)揮AECs與膠原海綿的協(xié)同作用，改善視神經(jīng) 軸突再生的局部微環(huán)境，增加RGCs的存活量，促進(jìn)視神經(jīng)軸突的再生。 3) AECs膠原海綿復(fù)合體用于修復(fù)視神經(jīng)損傷的方法是可行的。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 原海綿復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞的計(jì)數(shù) 個(gè)復(fù)合體的冰凍切片(厚度 5 μm)，PBS 洗 3×000，0.4% Triton X-100 稀釋），室溫 5 min。5 min，碳酸甘油熒光封片劑封片，熒光顯微拍照，用 Image Pro Plus 6.0 軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。每 mm2的細(xì)胞個(gè)數(shù)=細(xì)胞總數(shù)÷（圖片實(shí)際海綿復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)觀察--HE 染色切片，自來水沖洗 5 min。蘇木精染色室溫 7 m75%酒精分色，85%、95%和 100%酒精梯度模型的制作和分組
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 視網(wǎng)膜鋪片注固定后取眼球，4%多聚甲醛4 后固定2.5 h。沿眼角膜鞏膜緣和玻璃體，，以留存的眼上直肌為標(biāo)志，保留上、下、鼻、顳四個(gè)央呈十字花樣剪開視杯，分離視網(wǎng)膜，用 0.5%明膠將其鋪在載視網(wǎng)膜尼氏染色和細(xì)胞計(jì)數(shù) 28 天的視網(wǎng)膜鋪片，自然晾干，自來水洗 5 min，甲苯胺藍(lán)室溫 min，梯度脫水，二甲苯透明后封片觀察。神經(jīng)乳頭后在留取的四個(gè)象限中，每個(gè)象限取 3 個(gè)視野（40×膜的中央、中間和外周（圖 2）。在軟件 Photoshop CS3 的輔助m的細(xì)胞和＜12 μm的細(xì)胞。進(jìn)一步計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞直徑≥12平均數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R779.1

【參考文獻(xiàn)】

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7 陳春林;葉劍;尹小磊;陳小t

本文編號：2516096