【摘要】：研究背景及目的： 老年性聾(presbycusis)是隨年齡增長(zhǎng)而引起聽覺器官衰老、退變進(jìn)而出現(xiàn)的雙側(cè)耳對(duì)稱的、緩慢進(jìn)行性的感音神經(jīng)性聽力減退，其病因主要可歸納為遺傳性因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中對(duì)后天環(huán)境因素與老年性聾的關(guān)系的影響多集中于環(huán)境噪音、耳毒性藥物、糖尿病、心血管病等等這些方面。 在對(duì)老年性聾的研究中發(fā)現(xiàn)該病重要的病理學(xué)變化是聽覺神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并且研究顯示老年性聾可能是中樞聽覺系統(tǒng)與外周聽覺系統(tǒng)功能聯(lián)合降低衰變的結(jié)果。 X染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白(X-chromsome-linkedinhibitor of apoptosis protein,XIAP)作為哺乳動(dòng)物類凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的重要成員，可同時(shí)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),可通過抑制caspase蛋白酶家族激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而在初級(jí)聽皮層中作為主要的分泌抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的GABA能神經(jīng)元，其在聽覺皮層的結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳導(dǎo)編碼過程中具有重要作用，本課題運(yùn)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)對(duì)聽覺皮層GABA能神經(jīng)元中XIAP基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，證明XIAP的表達(dá)水平對(duì)聽覺皮層GABA能神經(jīng)元的凋亡有重要作用，，并揭示GABA能神經(jīng)元在老年性聾疾病發(fā)生及發(fā)展中的作用。為老年性聾的發(fā)生發(fā)展提供重要理論依據(jù)，為防治老年性聾提供新的參考意見。 材料和方法： 1.聽皮層GABA能神經(jīng)元凋亡對(duì)老年性聾疾病發(fā)生發(fā)展的影響及作用。 隨機(jī)抽取年輕組(2月齡)、老年組(10月齡)C57BL/6J健康小鼠各20只檢測(cè)ABR后，獲取皮層標(biāo)本，雙熒光抗體間接染色-激光共聚焦檢測(cè)兩組聽皮層GABA能神經(jīng)元凋亡程度及XIAP的表達(dá)水平。 2.針對(duì)XIAP基因ShRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定。 通過Gene Bank查找小鼠XIAP全組基因序列，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)3條干擾序列，構(gòu)建成干擾質(zhì)粒，測(cè)序鑒定后命名為XIAP-ShRNA-A、XIAP-ShRNA-B、 XIAP-ShRNA-C，經(jīng)鑒定后在體外細(xì)胞水平檢驗(yàn)其功能及作用效果，即：原代培養(yǎng)孕14~16天C57/BL6J小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，純化并進(jìn)行β-tubulin熒光染色鑒定；同批次細(xì)胞導(dǎo)入XIAP-ShRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)RT-PCR、western-blot檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)XIAP表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)導(dǎo)入后神經(jīng)元凋亡情況，證明其功能效果并篩選最佳干擾序列質(zhì)粒。 3.活體內(nèi)檢測(cè)XIAP-ShRNA干擾質(zhì)粒對(duì)老年性聾聽皮層GABA能神經(jīng)元的作用。 在立體定位儀及微量注射儀的幫助下將XIAP-ShRNA質(zhì)粒導(dǎo)入聽皮層，并于導(dǎo)入前、導(dǎo)入后14天和1月，檢測(cè)ABR，并利用TUNEL法，檢測(cè)年輕組及老年組C57BL/6J小鼠聽覺皮層GABA能神經(jīng)元凋亡，XIAP的表達(dá)水平，確定皮層神經(jīng)元凋亡程度及其與各自對(duì)照組差異。并通過檢查聽覺皮層中caspase-3的表達(dá)情況探討GABA神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。 結(jié)果： 1.年輕組小鼠ABR檢測(cè)1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz聽力閾值分別為23.50±3.15dB SPL、32.75±4.99dB SPL、40.5±5.36dB SPL、60.25±5.73dB SPL、66.00±6.19dB SPL，而老年組小鼠在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz的聽力閾值為60.50±6.69dB SPL、62.25±4.02dB SPL、65.75±4.55dB SPL、81.50±4.77dB SPL、85.50±4.44dB SPL。在各個(gè)頻率上老年組聽力閾值均比年輕組顯著增高(P0.01)。 2.在年輕組小鼠聽皮層中GABA能神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性的數(shù)目較小，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)，TUNEL法結(jié)合間接免疫熒光法檢測(cè)聽皮層凋亡的GABA能神經(jīng)元數(shù)目約為：10.22±0.84，而同樣的方法檢測(cè)老年性小鼠聽皮層中凋亡的GABA能神經(jīng)元數(shù)目約為19.17±4.06。老年組小鼠比年輕組小鼠聽皮層凋亡的GABA能神經(jīng)元明顯增多(P0.01),而年輕組小鼠聽皮層的GABA能神經(jīng)元XIAP表達(dá)數(shù)目較多，經(jīng)分析計(jì)數(shù)，其數(shù)目為：47.83±6.77,老年組小鼠聽皮層的XIAP數(shù)目為：13.27±6.94,年輕組聽皮層表達(dá)XIAP的GABA能神經(jīng)元明顯多于老年組(P0.01)。 3.通過Gene Bank查找小鼠XIAP全組基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠XIAP基因的3條RNA干擾序列，合成后構(gòu)建干擾質(zhì)粒，測(cè)序鑒定后命名為XIAP-ShRNA-A、 XIAP-ShRNA-B、 XIAP-ShRNA-C并轉(zhuǎn)染進(jìn)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細(xì)胞中，經(jīng)RT-PCR、Western-Blot檢測(cè)證實(shí)其能有效抑制原代培養(yǎng)的細(xì)胞中XIAP的表達(dá)；而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元凋亡增加，綜合評(píng)定其中以XIAP-ShRNA-C干擾序列效果最為明顯。 4.XIAP-ShRNA對(duì)C57BL/6J小鼠聽功能的影響 將XIAP-ShRNA-C質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠皮層后2周后，年輕組小鼠實(shí)驗(yàn)組ABR在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz閾值分別為:39.25±5.07dB SPL、44.50±6.87dB SPL、52.25±5.80dB SPL、70.00±6.52dB SPL、79.50±5.68dB SPL，年輕組對(duì)照組聽力閾值為：27.25±4.87dB SPL、38.75±6.68dBSPL、48.25±5.07dB SPL、64.00±5.37dB SPL、70.50±6.30dB SPL;而老年組小鼠實(shí)驗(yàn)組ABR在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz閾值分別為:74.25±4.81dB SPL、75.75±6.75dB SPL、78.75±7.89dB SPL、85.50±4.44dB SPL、87.75±2.94dB SPL，老年組對(duì)照組為：68.50±5.02dB SPL、70.75±6.37dB SPL、73.75±6.10dB SPL、81.75±3.96dB SPL、84.50±4.15dB SPL，導(dǎo)入1月后年輕組實(shí)驗(yàn)組各頻率ABR為：44.00±6.04dB SPL、49.50±5.45dB SPL、56.00±4.06dB SPL、75.00±5.92dB SPL、82.00±5.57dB SPL，而對(duì)照組為：34.50±5.89dB SPL、44.50±4.71dB SPL、52.00±4.30dB SPL、71.25±4.14dB SPL、72.25.±8.31dB SPL,導(dǎo)入1月后老年組實(shí)驗(yàn)組各頻率ABR為：77.25±4.60dB SPL、80.00±3.87dB SPL、83.75±3.83dB SPL、88.25±2.86dB SPL、88.50±2.29dB SPL，而對(duì)照組為：71.50±5.26dB SPL、76.75±3.63dB SPL、81.50±5.94dB SPL、84.75±5.36dBSPL、87.00±4.30dB SPL，通過統(tǒng)計(jì)顯示，導(dǎo)入2周后，年輕實(shí)驗(yàn)組比干擾前ABR閾值顯著升高(P0.01)，與年輕對(duì)照組比較實(shí)驗(yàn)組ABR閾值升高(P0.05)其中以1KHz、8KHz、16KHz閾值升高最顯著(P0.01)；老年實(shí)驗(yàn)組比干擾前ABR閾值升高(P0.05)，與相應(yīng)對(duì)照組比較老年實(shí)驗(yàn)組ABR閾值升高(P0.05)，其中以8KHz、16KHz閾值升高最顯著(P0.01)；導(dǎo)入1月后，與對(duì)照組比較年輕實(shí)驗(yàn)組ABR閾值升高(P0.05)，以1KHz、2KHz、16KHz閾值升高最顯著(P0.01)，老年實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較ABR閾值升高(P0.05)，而由于聽力閾值上限為90dB SPL，故16KHz無(wú)明顯差異。 5. XIAP-ShRNA對(duì)C57BL/6J小鼠聽皮層GABA能神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL法結(jié)合間接免疫熒光法檢測(cè)導(dǎo)入XIAP-ShRNA-C質(zhì)粒后2周聽皮層凋亡的GABA能神經(jīng)元數(shù)目年輕實(shí)驗(yàn)組為：18.21±3.90，年輕對(duì)照組為：12.22±0.63。老年實(shí)驗(yàn)組為：7.18±2.10，老年對(duì)照組為：17.42±3.39，在年輕組，實(shí)驗(yàn)組凋亡的GABA能神經(jīng)元比對(duì)照組多，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而在老年組，由于聽皮層神經(jīng)元已大量凋亡消失，因此無(wú)法直接檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)組凋亡的GABA能神經(jīng)元，故檢測(cè)值反低于對(duì)照組。但通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組殘存的GABA能神經(jīng)元可知實(shí)驗(yàn)組凋亡的GABA能神經(jīng)元比對(duì)照組多(P0.05)。 6. XIAP-ShRNA對(duì)C57BL/6J小鼠聽皮層XIAP的影響 導(dǎo)入2周后聽皮層中表達(dá)XIAP的GABA能神經(jīng)元數(shù)目年輕實(shí)驗(yàn)組為：35.29±9.83，年輕對(duì)照組為：52.47±4.58，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組聽皮層表達(dá)XIAP的GABA能神經(jīng)元數(shù)目少，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),老年實(shí)驗(yàn)組為：8.45±6.62，老年對(duì)照組為：16.77±8.35，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組聽皮層表達(dá)XIAP的GABA能神經(jīng)元數(shù)目少，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而同樣使用Western-Blot檢測(cè)導(dǎo)入后小鼠皮層XIAP的表達(dá)顯示年輕實(shí)驗(yàn)組比年輕對(duì)照組分別少23.61%，老年實(shí)驗(yàn)組比老年對(duì)照組分別少20.73%，兩者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 7. XIAP-ShRNA對(duì)C57BL/6J小鼠聽皮層caspase-3的影響 導(dǎo)入2周后聽皮層中表達(dá)caspase-3的GABA能神經(jīng)元數(shù)目年輕實(shí)驗(yàn)組為：19.20±4.02，年輕對(duì)照組為：14.77±4.33，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組聽皮層表達(dá)caspase-3的GABA能神經(jīng)元數(shù)目多，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),老年實(shí)驗(yàn)組為：13.52±5.73，老年對(duì)照組為：14.27±5.29，因此時(shí)神經(jīng)元已大量凋亡，因此檢測(cè)值不能直接反映聽皮層GABA能神經(jīng)元caspase-3表達(dá)情況，而聯(lián)系老年實(shí)驗(yàn)組的GABA神經(jīng)元數(shù)為：18.62±4.38，少于對(duì)照組的29.23±7.23，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論： 1.C57BL/6J小鼠隨年齡增長(zhǎng)，聽力減退，其大腦聽皮層GABA能神經(jīng)元凋亡增加，可能是老年性聾的發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素。 2.XIAP在不同年齡的C57/BL6J小鼠聽皮層中的表達(dá)水平有差異。同時(shí)XIAP在不同年齡的C57/BL6J小鼠聽皮層GABA能神經(jīng)元中表達(dá)有差異，可能是導(dǎo)致聽皮層的GABA能神經(jīng)元凋亡的重要因素。 3.運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制原代培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠皮層神經(jīng)元中XIAP的表達(dá)，可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加。 4.在C57BL/6J小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制C57/BL6J小鼠聽皮層中XIAP的表達(dá)，可導(dǎo)致皮層caspase-3表達(dá)增多，并導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元數(shù)目減少，凋亡增加，引起小鼠聽力下降。XIAP的表達(dá)與GABA能神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)，可能在老年性聾發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R764

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅勛;華田苗;孫慶艷;朱再滿;張長(zhǎng)征;;貓初級(jí)聽皮層γ-氨基丁酸能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)變化[J];解剖學(xué)報(bào);2006年05期

2 胡s

本文編號(hào)：2455911