【摘要】：背景和目的 老年黃斑病變(age-related macular degeneration, AMD)是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致不可逆視力損傷的最常見原因，，其中濕性AMD為國(guó)內(nèi)外50歲以上人群低視力和致盲的重要原因，發(fā)病率不斷增加。脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularazition, CNV)形成是其危害視功能的主要病理基礎(chǔ)和首要原因。 在觸發(fā)CNV的機(jī)制中，VEGF與抗血管生成因子之間的失衡尤為重要。VEGF是一種分泌性蛋白質(zhì)，它可誘發(fā)血管生成，增加血管滲透性，引發(fā)炎癥，而這些因素又與濕性AMD的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。因此，眾多學(xué)者在開發(fā)濕性AMD治療藥物時(shí)，都將VEGF當(dāng)作潛在的治療靶標(biāo)，比如以適配子或者抗VEGF抗體片段形式出現(xiàn)的哌格太尼、蘭尼單抗、Avastin等。而這些方法存在的問(wèn)題主要包括不能在患部長(zhǎng)效存在，即使應(yīng)用各種緩釋技術(shù)，由于局部微環(huán)境病理性VEGF長(zhǎng)時(shí)間分泌，因此仍無(wú)法滿足抑制VEGF的需求；尤為重要的是這些藥物與VEGF結(jié)合后，由于代謝的困難，存在加重drusen的危險(xiǎn)，所以抑制VEGF的產(chǎn)生將比降解或拮抗它更有利于AMD的治療。同時(shí)脂褐質(zhì)過(guò)載的RPE細(xì)胞功能障礙始終是AMD的一個(gè)重要的不利因素，在CNV的形成和發(fā)展中起著重要的作用。Bruch’s膜的粗糙，彈力纖維層變薄甚至斷裂，RPE和Bruch’s膜粘附力下降，為CNV的生長(zhǎng)提供了有利條件和促進(jìn)因素，或者是誘因之一。因此，雖然目前血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular enthothelial growth factor，VEGF)抗體和光動(dòng)力療法等對(duì)CNV具有短期療效，但對(duì)視功能恢復(fù)作用甚微。目前尚無(wú)能同時(shí)有效阻抑CNV和修復(fù)脈絡(luò)膜-Bruch’s-RPE膜復(fù)合體的治療措施。 作為一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，F(xiàn)ibulin5(Fbln5)基因在AMD病程發(fā)展中，尤其在CNV形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。首先，在體內(nèi)可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及粘附，并且具有明顯抑制新生血管的作用，雖然目前不能完全了解其對(duì)抗新生血管形成及VEGF作用的機(jī)制，但許多體內(nèi)和體外研究證實(shí)了FBLN5可以從多個(gè)環(huán)節(jié)中對(duì)抗新生血管的形成，并且是通過(guò)RGD基序起作用的抑制新生血管形成的機(jī)理。其次，F(xiàn)BLN5能防止彈性蛋白病變的發(fā)生，同時(shí)充當(dāng)載脂蛋白A和整合素的配體，F(xiàn)BLN5可通過(guò)鈣依賴結(jié)合彈性蛋白的方式，促進(jìn)彈性纖維組裝并結(jié)合到微纖維系統(tǒng)中。FBLN5缺乏時(shí)由于深部彈力纖維結(jié)構(gòu)的破壞，可引起皮膚、肺和脈管系統(tǒng)顯著的異常。FBLN5的這兩個(gè)重要作用恰好可以用來(lái)從不同環(huán)節(jié)抑制CNV，已有研究表明在眼部FBLN5可由RPE分泌，參與Bruch’s膜及部分玻璃膜疣的組裝。另外，有系列研究發(fā)現(xiàn)在Fbln5基因突變與AMD具有相關(guān)性，并認(rèn)為是其致病基因之一。Fbln5的突變改變了與彈性蛋白原的連接特性，可能導(dǎo)致Bruch’s膜正常彈性纖維的組裝及穩(wěn)定性異常；同時(shí)Fbln5的突變干擾了RPE與Bruch’s膜的正常粘附關(guān)系，這與AMD的血管模型的發(fā)病機(jī)制相符。因此，本課題假設(shè)：過(guò)表達(dá)FBLN5的RPE(Fbln5-RPE)視網(wǎng)膜下移植既能抑制VEGF產(chǎn)生又能補(bǔ)充RPE修復(fù)脈絡(luò)膜-Bruch’s-RPE膜復(fù)合體，可能是治療AMD的新手段。 本研究?jī)?nèi)容是構(gòu)建Fbln5慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染RPE；體外檢測(cè)其對(duì)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(Coroidal Endothelial Cells)增殖、遷移功能的影響及分子機(jī)制；將Fbln5-RPE移植到CNV動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜下腔，通過(guò)手術(shù)前后眼底血管熒光造影檢測(cè)研究對(duì)CNV的抑制作用，由此，探討RPE轉(zhuǎn)染Fbln5后移植治療CNV的效果和作用機(jī)制。 研究方法 1.應(yīng)用Rat Fbln5全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒(pExpress-1-Fbln5)，構(gòu)建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)Long Evans(LE)大鼠RPE，采用Quantitative real-timePCR(Q-PCR)方法，從基因水平檢測(cè)慢病毒FBLN5的過(guò)表達(dá)。提取培養(yǎng)上清液，進(jìn)行FBLN5的Western-Blot檢測(cè)，檢測(cè)分析所構(gòu)建慢病毒FBLN5過(guò)表達(dá)和分泌至細(xì)胞外的能力。 2. Fbln5-RPE對(duì)CECs增殖和遷移抑制作用及其機(jī)制的研究，實(shí)驗(yàn)分為三組，即單純RPE組(空白對(duì)照)、GFP空載轉(zhuǎn)染RPE(GFP-RPE)組(陰性對(duì)照)和Fbln5-RPE組(實(shí)驗(yàn)組)。采用Transwell共培養(yǎng)體系將上述三種RPE細(xì)胞分別與RF/6A猴脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系(choroidal endothelial cells，CECs)進(jìn)行共培養(yǎng)。按遷移模式共培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)穿透小室底膜的CECs數(shù)量和OD值，研究FBLN5抑制CECs遷移的作用。按增殖模式分別共培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，應(yīng)用甲基噻唑基四唑細(xì)胞增殖檢測(cè)法(Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium, MTT)和流式細(xì)胞周期檢測(cè)法對(duì)Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用進(jìn)行研究。同時(shí)，Q-PCR檢測(cè)Fbln5-RPE對(duì)共培養(yǎng)CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表達(dá)的影響，探索其作用機(jī)制。 3.建立Long Evans大鼠CNV模型，視網(wǎng)膜下腔移植Fbln5-RPE，研究其抑制體內(nèi)CNV生成的作用，按轉(zhuǎn)染RPE病毒種類的不同分為GFP-RPE組(陰性對(duì)照)和Fbln5-RPE組(實(shí)驗(yàn)組)。在移植前和移植后1、2、3、4周分別行眼底血管造影(FundusFluorescein Angiography, FFA)檢查，分析移植前后CNV滲漏面積比值和計(jì)數(shù)比值，進(jìn)行兩組間的統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 第一部分Fibulin5慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染RPE的研究 1.成功構(gòu)建pZlen-IRES-Fbln5-GFP慢病毒表達(dá)載體，基因測(cè)序結(jié)果顯示完全正確，感染RPE的效率在70-80%左右。 2.成功體外原代培養(yǎng)了LE大鼠RPE，純度大于90%，具有富含色素、呈多角形的形態(tài)特點(diǎn)，廣譜角蛋白DAB鑒定陽(yáng)性，隨著傳代色素會(huì)越來(lái)越少、形態(tài)梭形變化。 3. Fbln5-RPE中Fbln5表達(dá)量是對(duì)照組的28倍以上。培養(yǎng)上清液WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FBLN5相對(duì)于對(duì)照組顯著過(guò)表達(dá)，并能高效分泌至細(xì)胞外。 第二部分Fbln5對(duì)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用及其機(jī)制研究 1.體外共培養(yǎng)遷移抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fbln5-RPE可顯著抑制CECs遷移透過(guò)Transwell小室底膜的數(shù)量(n=5，P 0.01)。而空載體對(duì)照組沒(méi)有這種效果(n=5， P0.05)。 2.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，MTT結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組，F(xiàn)bln5-RPE均可顯著抑制CECs的OD值(n=5，P 0.05)，提示Fbln5-RPE具有抑制CECs增殖的作用。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=5， P0.05)。 3.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，F(xiàn)bln5-RPE均可顯著抑制CECs細(xì)胞S期的比例和細(xì)胞增殖指數(shù)，其增殖顯著受到抑制(n=3，P 0.05)，進(jìn)一步證明Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=3， P0.05)。而各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CECs的凋亡系數(shù)三組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=3， P0.05)。 4.體外共培養(yǎng)第1、2、3天，Q-PCR發(fā)現(xiàn)相對(duì)于兩個(gè)對(duì)照組，F(xiàn)bln5-RPE下調(diào)了CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)倍數(shù)統(tǒng)計(jì)分析有顯著差異(n=3，P 0.01)，提示Fbln5-RPE下調(diào)CXCR4，VEGF可能是抑制CECs增殖和遷移的作用機(jī)制。 第三部分激光誘導(dǎo)CNV模型視網(wǎng)膜下腔移植Fbln5-RPE的體內(nèi)研究 1.成功建立激光誘導(dǎo)LE大鼠CNV模型，1-5周FFA顯示70%左右的激光點(diǎn)有熒光素滲漏，同期眼球冰凍切片可見CNV形態(tài)。 2.移植后1、2、3、4周后， GFP綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞在神經(jīng)視網(wǎng)膜下腔排列成帶狀，并向視網(wǎng)膜層間遷移。移植后第2、3、4周，CNV滲漏面積比值和CNV數(shù)量比值，實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組(n=3，P 0.05)，提示Fbln5-RPE視網(wǎng)膜下腔移植有抑制CNV的作用。 全文結(jié)論與學(xué)術(shù)意義 1.成功構(gòu)建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表達(dá)系統(tǒng)并率先應(yīng)用到眼科新生血管性疾病的研究中。充分利用了慢病毒長(zhǎng)期、高效和整合基因組的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)尤其是需要較長(zhǎng)期觀察的體內(nèi)試驗(yàn)提供了有利條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別從基因水平和蛋白水平證明了FBLN5能高效表達(dá)于RPE細(xì)胞并且分泌至細(xì)胞外，為進(jìn)一步的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。 2.應(yīng)用Transwell共培養(yǎng)體系，從基質(zhì)膠遷移實(shí)驗(yàn)、MTT、細(xì)胞周期、增殖指數(shù)和凋亡系數(shù)等多個(gè)層面充分證實(shí)了Fbln5-RPE能顯著抑制共培養(yǎng)CECs的增殖和遷移，并發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)共培養(yǎng)CECs中VEGF和CXCR4表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究提示Fblin5-RPE可能具有抗CNV形成的作用。 3.成功建立激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型，將Fbln5-RPE移植于動(dòng)物模型視網(wǎng)膜下腔，率先發(fā)現(xiàn)Fbln5-RPE可顯著降低CNV熒光素滲漏面積和減少CNV數(shù)量，證實(shí)了Fbln5-RPE移植可抑制CNV生成。綜合體外和體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，本研究提示Fbln5-RPE移植為臨床治療CNV提供了一定的理論基礎(chǔ)，有望成為一種治療CNV性AMD的新策略。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R773.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙世紅,何守志;氪激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型研究[J];中華眼科雜志;2003年05期

本文編號(hào)：2441252