發(fā)布時間：2019-01-05 03:35

【摘要】：研究背景感音神經(jīng)性聾是一種較為常見的聲波感受和聲波傳導障礙性疾病,多為重度耳聾。該病的病變常常發(fā)生于柯蒂氏器的內外毛細胞、聽神經(jīng)及各級聽中樞,患者對于聲音的感受與神經(jīng)沖動的傳導發(fā)生障礙,從而引起聽力的下降。感音神經(jīng)性耳聾極大的影響了患者的生活質量。感音神經(jīng)性耳聾分為感音性耳聾(病變位于毛細胞,又稱耳蝸性聾)和神經(jīng)性耳聾(病變位于聽神經(jīng)及其傳導通路,又稱蝸后性聾)。蝸后性耳聾由于神經(jīng)細胞的缺乏自我修復的能力而很難治愈。對于感音神經(jīng)性聾的恢復策略,最新的探索表明干細胞植入是潛在的治療手段。干細胞具有多向分化能力,有分化為新的毛細胞、神經(jīng)細胞和支持細胞的潛能。許多研究都表明,Wnt信號通路對于神經(jīng)干細胞的增殖發(fā)揮著決定性作用。并且,Wnt信號通路的激活有可能可以使非神經(jīng)元細胞再次進入細胞周期轉變?yōu)樯窠?jīng)元細胞,這就使得治療蝸后性聾成為了可能。Wnt信號通路是一種在進化中高度保守的信號通路,在多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌的與細胞膜上的受體結合,激活下游的信號通路,調節(jié)靶基因的表達從而影響著極細胞、干細胞等的細胞增殖、分化與凋亡的過程。通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生有關。Wnt信號通路分為兩種,經(jīng)典的Wnt信號通路和非經(jīng)典的Wnt信號通路。β-連環(huán)蛋白的富集與入核是經(jīng)典Wnt信號通路激活的標志。β-連環(huán)蛋白入核后與轉錄因子結合從而調節(jié)下游目的基因的表達。而非經(jīng)典的Wnt信號通路,不依賴于β-連環(huán)蛋白,是由其他的一些蛋白或離子參與構成。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的缺失可引起神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。而有大量研究表明,耳毒性藥物、噪聲、缺氧、衰老等常見損傷,均可造成小鼠耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡,造成耳聾。而目前對于耳毒性藥物的研究,較多集中在順鉑等藥物。紫杉醇由于其與順鉑常常聯(lián)合使用,其耳毒性往往為順鉑所掩蓋,研究較少。而研究也表明紫杉醇確實具有神經(jīng)毒性,可以猜測紫杉醇的耳毒性是對耳的神經(jīng)細胞造成了影響。螺旋神經(jīng)節(jié)作為聽覺通路的第一級神經(jīng)元,有理由懷疑紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)有損傷作用而這一作用正是它耳毒性的原因。本研究通過組織培養(yǎng)的方式來探究紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)是否具有獨立的損傷作用,并探討Wnt信號通路對于紫杉醇的作用是否具有一定的影響。實驗目的以C57BL/6小鼠作為研究對象,探討紫杉醇本身是否對小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)產生獨立的損傷作用,若有損傷,則進一步探討其機制及Wnt信號通路在此過程中的作用。實驗方法1.選取出生后3天(p3)野生型的C57BL/6品系小鼠為研究對象,取小鼠耳蝸中轉(帶螺旋神經(jīng)節(jié))分組進行原代培養(yǎng)。2.分別使用不同濃度紫杉醇培養(yǎng),利用MTT法測定細胞存活程度,并選取合適濃度進行進一步實驗。將小鼠耳蝸中轉隨機分為四組,分別使用培基(不加藥的空白對照)、紫杉醇、紫杉醇+Wnt信號通路激動劑(Wnt3a)、紫杉醇+Wnt信號通路抑制劑(IWP2)來處理中轉(帶螺旋神經(jīng)節(jié))48h,之后分別進行免疫熒光染色和TUNEL染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維的變化。使用蛋白印跡試驗(Westernblot)來印證免疫熒光染色的實驗結果。3.紫杉醇腹腔注射一月齡小鼠,測聽后解剖,取耳蝸制作冰凍切片進行免疫熒光染色,觀察螺旋神經(jīng)節(jié)的變化。實驗結果1.MTT結果顯示,1μl紫杉醇即可造成細胞存活率的下降,紫杉醇對螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷呈現(xiàn)濃度依賴,后續(xù)實驗選用30μl濃度進行。免疫熒光染色顯示,紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)結構被破壞,細胞數(shù)量減少,神經(jīng)纖維數(shù)量減少。2.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)破壞,出現(xiàn)了胞質致密,染色質邊集,核固縮及凋亡小體等凋亡表現(xiàn)。而TUNEL染色證實了凋亡的存在。3.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞Caspase-3染色陽性。蛋白印跡試驗也證實了 Caspase-3的表達增多。4.加入Wnt信號通路激動劑組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量介于對照組和紫杉醇組之間,形態(tài)較紫杉醇組稍好,神經(jīng)纖維基本整齊排列。加入抑制劑組螺旋神經(jīng)節(jié)結構嚴重破壞,細胞數(shù)量大量少,形態(tài)破壞較為嚴重,凋亡明顯,神經(jīng)纖維破壞嚴重。5.腹腔注射紫杉醇造模后的一月齡小鼠測聽結果顯示與正常一月齡小鼠并無顯著差別,但冰凍切片顯示耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞存在損傷和凋亡。結論1.紫杉醇對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有明顯損傷作用。2.損傷作用通過激活Caspase-3,誘導凋亡實現(xiàn)。3.Wnt信號通路對于紫杉醇的損傷具有一定的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R764.43

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本文編號：2401211