【摘要】：目的 先天性小瞼裂綜合征(BPES),是一種較罕見(jiàn)的先天性常染體顯性遺傳疾病,其眼部典型臨床表現(xiàn)以瞼裂狹小、上瞼下垂、反向內(nèi)眥贅皮、內(nèi)眥間距增寬為特征。該綜合征分為兩種亞型：Ⅰ型,外顯率100%,由父親傳代,女性患者不育；Ⅱ型,外顯率96.5%,父親、母親傳代機(jī)會(huì)均等,男女患者均只累及眼部而可以生育。FOXL2基因是BPES首位致病候選基因。FOXL2基因突變是如何影響其轉(zhuǎn)錄功能導(dǎo)致BPES發(fā)生的具體分子學(xué)機(jī)制尚未明確,是目前BPES研究的熱點(diǎn)。本研究收集了兩個(gè)BPES家系,進(jìn)行臨床表型和遺傳規(guī)律分析。檢測(cè)候選致病基因FOXL2突變位點(diǎn),運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)突變FOXL2基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè),并觀察突變基因在體外細(xì)胞中的表達(dá)和功能改變,探索突變型FOXL2導(dǎo)致BPES發(fā)生的可能機(jī)制。 方法 1本研究收集了就診于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院眼科的兩個(gè)BPES家系。家系成員接受病史調(diào)查和眼科檢查,進(jìn)行臨床表型和遺傳規(guī)律分析。 2抽取家系成員和正常對(duì)照者外周血,提取DNA,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)FOXL2基因進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)。應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)突變位點(diǎn)雜合子含量進(jìn)行定量檢測(cè),分析其與表型輕重的關(guān)系。應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)FOXL2基因突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。 3利用重組DNA技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1,構(gòu)建野生型和突變型基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后觀察蛋白亞細(xì)胞定位；同時(shí)克隆至載體pCDB,質(zhì)粒構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后應(yīng)用RT-PCR測(cè)定其對(duì)靶基因OSR2的調(diào)控改變 結(jié)果 1家系一4代均有發(fā)病,符合BPESI臨床診斷者6例,男3例,女3例。家系二3代均有發(fā)病,其中BPES患者7例,男4例,女3例。除了家系一中患者Ⅲ：2表現(xiàn)為輕度上瞼下垂,反向內(nèi)眥贅皮不明顯,其他所有患者均有明顯的瞼裂狹小、上瞼下垂、內(nèi)眥間距增寬以及反向內(nèi)眥贅皮表現(xiàn)。家系二中有一例女性患者未婚,其余女性患者均能生育。兩個(gè)家系患者診斷均符合BPESII型,遺傳方式符合單基因常染色體顯性遺傳方式。 2測(cè)序結(jié)果：家系一發(fā)現(xiàn)FOXL2基因的模板鏈中第162位堿基出現(xiàn)一雜合峰,鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?c.162GD,密碼子由AAG突變?yōu)锳AT,第54位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?p.Lys54Asn)。家系二發(fā)現(xiàn)FOXL2基因的模板鏈中第308位堿基出現(xiàn)一雜合峰,鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?c.308GA),密碼子由CGC突變?yōu)镃AC,第103位的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(p.Argl03His).均為首次報(bào)道的新突變位點(diǎn)。焦磷酸測(cè)序結(jié)果：家系一中患者Ⅲ：2突變位點(diǎn)雜合子含量中突變堿基的含量低于正常堿基的含量,其他患者突變位點(diǎn)雜合子含量中突變堿基的含量高于正常堿基的含量。生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)提示FOXL2(c.162GT)和FOXL2(c.308GA)兩突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響,但有可能造成蛋白亞細(xì)胞定位異常和損害其功能。 3成功構(gòu)建攜帶野生型FOXL2基因的質(zhì)粒pEGFP-N1-FOXL2WT,以及攜帶C.162G＞T突變型FOXL2基因質(zhì)粒pEGFP-N1-FOXL2-MUT1,和c.308GA突變型FOXL2基因質(zhì)粒pEGFP-N1-FOXL2-MUT2。轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)野生型FOXL2蛋白定位于核內(nèi),c.162GT突變FOXL2蛋白和c.308GA突變FOXL2蛋白也表達(dá)于核內(nèi),胞漿內(nèi)無(wú)表達(dá)。成功構(gòu)建攜帶野生型FOXL2基因的質(zhì)粒pCDB-FOXL2WT,以及攜帶c.162GT突變型FOXL2基因質(zhì)粒pCDB-FOXL2-MUT1,和c.308GA突變型FOXL2基因質(zhì)粒pCDB-FOXL2-MUT.轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后,野生型FOXL2促進(jìn)細(xì)胞中OSR2mRNA含量較空載體明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而c.162GT突變FOXL2和c.308GA突變FOXL2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的OSR2mRNA含量與野生型FOXL2相比明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1本研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)導(dǎo)致BPESII型的FOXL2錯(cuò)義突變：c.162GT和c.308GA,均為首次報(bào)道的新突變位點(diǎn)。 2家系一患者Ⅲ：2的眼部畸形表現(xiàn)比較輕可能與突變位點(diǎn)雜合子突變堿基的含量低于正常堿基的含量有關(guān)。 3c.162GT突變型FOXL2基因和c.308GA突變型FOXL2基因編譯蛋白其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與野生型FOXL2蛋白沒(méi)有明顯差異,同時(shí)亞細(xì)胞定位都位于核內(nèi),但該兩突變降低OSR2基因的表達(dá),推測(cè)本研究?jī)蓚�(gè)家系FOXL2突變可能通過(guò)降低對(duì)靶基因OSR2的調(diào)控作用,從而導(dǎo)致BEPS的發(fā)生。 4本研究擴(kuò)寬了BPES的基因突變譜,同時(shí)揭示了突變基因?qū)е翨PES發(fā)生的可能機(jī)制,為先天性小瞼裂綜合征的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R777.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李秀琪;王太玲;王佳琦;;小瞼裂綜合征中FOXL2基因突變[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2012年08期

2 Chunxia Peng;Xiaobei Yin;Mengda Li;Ting He;Genlin Li;;Construction of a eukaryotic expression plasmid for human retina-derived neurotrophin-3[J];Neural Regeneration Research;2013年11期

3 李爽;李冬梅;艾立坤;陳濤;趙穎;;先天性小瞼裂綜合征患者屈光狀態(tài)分析及分期手術(shù)治療[J];眼科;2009年06期

4 黃渭清,喬群,趙茹;先天性瞼裂狹小綜合征的手術(shù)治療策略[J];整形再造外科雜志;2005年03期

5 溫臣婷;唐微;李國(guó)保;張有順;;瞼裂狹小綜合征Ⅱ型一家系未檢測(cè)到FOXL2基因突變[J];眼科新進(jìn)展;2012年11期

，

本文編號(hào)：2401888