【摘要】：第一部分化膿性中耳炎大鼠中耳黏膜細(xì)菌生物膜的形成特點(diǎn)及意義目的建立化膿性中耳炎大鼠模型,觀察細(xì)菌生物膜在模型動(dòng)物中耳黏膜的形成特點(diǎn),探討細(xì)菌生物膜在慢性化膿性中耳炎發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。方法將28只大鼠分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組4只；另外取4只大鼠進(jìn)行HE染色觀察。除對(duì)照組外所有實(shí)驗(yàn)組大鼠及2只將行HE染色的大鼠用濃度為1.0×106CFU/m1的銅綠假單胞菌菌液經(jīng)鼓膜穿刺途徑感染雙側(cè)中耳腔。分別在接種細(xì)菌后第1、3、6、10、15、21天,將一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的4只大鼠麻醉后,用電耳鏡觀察雙側(cè)鼓膜,從大體病理學(xué)水平對(duì)炎癥的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分(用0、1、2、3、4表示炎癥程度,0為幣常,4為最嚴(yán)重)；處死后取雙側(cè)聽泡,左側(cè)聽泡制備成掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)標(biāo)本并觀察中耳黏膜細(xì)菌生物膜形態(tài),右側(cè)聽泡采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)觀察中耳黏膜細(xì)菌生物膜形態(tài)。對(duì)照組在第0天即處死取材。兩只末感染的將行HE染色的大鼠亦在第0天處死取材；兩只感染的將行HE染色的大鼠在第7天處死取雙側(cè)聽泡。用常規(guī)方法制作HE切片,并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果(1)HE染色觀察：被感染的大鼠中耳黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其間可見新生毛細(xì)血管形成,表明經(jīng)鼓膜注菌7天時(shí)已形成化膿性中耳炎。(2)用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠中耳黏膜標(biāo)本,均在接種細(xì)菌第6天左右觀察到細(xì)菌生物膜形成,到第10天形態(tài)更加典型,并在3周內(nèi)形態(tài)保持穩(wěn)定。(3)用電耳鏡觀察大鼠鼓膜可以看出,中耳炎炎癥感染程度在接種細(xì)菌10天內(nèi)逐漸加重,10天時(shí)達(dá)到高峰并持續(xù)至第3周。1日組與6日組、6日組與10日組鼓膜炎癥狀態(tài)評(píng)分比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.55、t=3.99；P0.05、P0.01)。結(jié)論(1)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型細(xì)菌生物膜形成過程為：1-5天是細(xì)菌粘附、聚集階段,6天時(shí)細(xì)菌生物膜三維結(jié)構(gòu)初步形成,10天左右達(dá)到成熟穩(wěn)定狀態(tài)。(2)隨著中耳黏膜細(xì)菌生物膜的生長(zhǎng)與成熟,中耳炎炎癥也在逐漸加重,提示中耳炎炎癥感染的嚴(yán)重程度與中耳黏膜細(xì)菌生物膜的成熟狀態(tài)密切相關(guān)。第二部分克拉霉素與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠中耳黏膜銅綠假單胞菌生物膜的清除作用目的在已形成銅綠假單胞菌生物膜的大鼠中耳腔內(nèi)局部使用環(huán)丙沙星及克拉霉素,觀察單獨(dú)應(yīng)用氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星以及與大環(huán)內(nèi)酯類藥物克拉霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)動(dòng)物體內(nèi)銅綠假單胞菌生物膜的清除效果。方法將36只大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(A組)、環(huán)丙沙星組(B組)、環(huán)丙沙星克拉霉素聯(lián)合組(C組),每組12只。所有大鼠右耳經(jīng)鼓膜穿刺向鼓室注入銅綠假單胞菌菌液,建立化膿性中耳炎模型。10天后,各組分別經(jīng)右側(cè)鼓膜穿刺向鼓室內(nèi)注入生理鹽水、環(huán)丙沙星藥液、環(huán)丙沙星克拉霉素混合藥液,每天1次。在第1次給藥后的第1、3、8、14天,每組各處死3只大鼠,取右側(cè)聽泡,對(duì)中耳黏膜行掃描電鏡檢查。所得圖像經(jīng)ImageJ軟件分析得出黏膜表面細(xì)菌生物膜覆蓋率。結(jié)果(1)A、B兩組第3、8、14天細(xì)菌生物膜覆蓋率保持在90%左右,在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且同一時(shí)間點(diǎn)上A、B兩組之間比較,差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)C組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)菌生物膜覆蓋率分別為88.11±6.09%、33.94±13.53%、19.52±9.34%,逐漸遞減,三者兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tc3c8.tc3c14、tc8c14分別為14.14、23.83、3.40,P值均0.01,)。(3)C組在第3天與A組、B組比較,其細(xì)菌生物膜覆蓋率與后兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組在第8、14天與A組、B組比較,其細(xì)菌生物膜覆蓋率小于后兩者,與后兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tc8A8.tc8B8、tc14A14、tc14B14分別為15.36、15.03、27.26、27.97,P值均0.001)。結(jié)論銅綠假單胞菌造成大鼠中耳黏膜形成細(xì)菌生物膜后,鼓室內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用環(huán)丙沙星和克拉霉素8天以上對(duì)細(xì)菌生物膜有明顯清除作用,而單獨(dú)應(yīng)用環(huán)丙沙星對(duì)中耳黏膜的細(xì)菌生物膜無明顯清除作用。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R764.21

【引證文獻(xiàn)】

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1 羅銳軍;陸春;李紀(jì)兵;賴維;;生物膜破壞及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J];皮膚性病診療學(xué)雜志;2014年02期

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本文編號(hào)：2359007