【摘要】：研究背景 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,絕大多數(shù)NPC分化差,惡性程度高,易早期發(fā)生頸淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前,鼻咽癌的臨床治療主要以放療和化療為主,5年生存率約50%-70%之間。中晚期NPC臨床療效差,再加上在鼻咽癌治療過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥性(multi-drug resistance, MDR),而導(dǎo)致化療失敗。因此,研究鼻咽癌耐藥的分子機(jī)制很有必要。 MDR是指惡性腫瘤細(xì)胞在接觸一種抗癌藥后,產(chǎn)生了對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其他抗癌藥的耐藥性。MDR是惡性腫瘤化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一,涉及到多種復(fù)雜的分子機(jī)制,其中,以多藥耐藥相關(guān)蛋白(multi-drug resistance protein, MRP)在抗癌藥物耐藥中所起的作用備受重視。 比較耐藥腫瘤細(xì)胞與其對(duì)應(yīng)的親本腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì),可以發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì),為篩選腫瘤耐藥的分子標(biāo)志物及腫瘤耐藥的靶向治療提供了新的研究方向。 第一章鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系的建立 目的：本研究通過(guò)順鉑(cis-Diammine-Dichloro-Platinum, cDDP)濃度遞增法建立了鼻咽癌耐藥的細(xì)胞株CNE2/cDDP,并研究其生物學(xué)行為。方法：采用cDDP濃度遞增法,經(jīng)過(guò)3個(gè)月左右的時(shí)間建立了鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系CNE2/cDDP,倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,MTT檢測(cè)不同細(xì)胞系的耐藥性。結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在不同藥物(順鉑、長(zhǎng)春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU)作用下,CNE2/cDDP較CNE2的IC50值及耐藥指數(shù)均有明顯的增加,CNE2/cDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性最強(qiáng),增加到200.6倍,對(duì)5-Fu的耐藥性最差,增加到2.8倍；耐藥細(xì)胞株CNE2/cDDP較非耐藥細(xì)胞株CNE2生長(zhǎng)速度減慢,其細(xì)胞倍增時(shí)間由18小時(shí)增加到24小時(shí)；CNE2/cDDP細(xì)胞體積較CNE2為小,常呈克隆聚集現(xiàn)象。結(jié)論：CNE2/cDDP不光對(duì)順鉑具有耐藥性,對(duì)其他化療藥物也具有不同的耐藥性,即具有MDR,并且該細(xì)胞系性狀穩(wěn)定,可穩(wěn)定地傳代和保存,是一個(gè)理想的用于鼻咽癌的多藥耐藥研究的細(xì)胞系,為下一步蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。 第二章鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系的耐藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究及耐藥關(guān)鍵蛋白功能研究 目的：本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離鑒定鼻咽癌耐藥細(xì)胞系的差異表達(dá)蛋白,并對(duì)其中的關(guān)鍵蛋白keratin1進(jìn)行功能研究,以揭示keratin1在鼻咽癌耐藥中的作用。方法：采用2-DE+MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定,獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異表達(dá)譜；并對(duì)其中的三個(gè)關(guān)鍵耐藥蛋白(KRT1,CTSD,ANXA5)表達(dá)水平進(jìn)行western blot驗(yàn)證;通過(guò)siRNA干擾KRT1表達(dá)后,觀察KRT1與鼻咽癌耐藥性的關(guān)系。結(jié)果：蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得了鼻咽癌細(xì)胞株CNE2與其順鉑耐藥細(xì)胞株CNE2/cDDP的差異蛋白表達(dá)譜,并鑒定了其中的17個(gè)差異表達(dá)蛋白,包括：角蛋白1,角蛋白18,膜聯(lián)蛋白A5,組織蛋白酶D, cDNA FLJ52723, NME2(轉(zhuǎn)移抑制蛋白),3,2-反式-烯酰輔酶A異構(gòu)酶,組蛋白2B,熱休克蛋白p-1,3-羥氨基-輔酶a脫氫酶-2,丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶,谷氨酸脫氫酶1,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase, α-烯醇酶,熱休克蛋白90a,NADH脫氫酶,核內(nèi)核糖體蛋白C1/C2等。這些蛋白功能涉及到：細(xì)胞骨架,基因組穩(wěn)定,分子伴侶,代謝相關(guān)酶,轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)信號(hào)通路,蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路等。其中三個(gè)蛋白KRT1,CTSD, ANXA5在耐藥細(xì)胞株中CNE2/cDDP中的表達(dá)水平均明顯上調(diào),與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的結(jié)果是一致的,說(shuō)明蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定獲得的差異蛋白表達(dá)譜是可靠的;keratin1在CNE2/cDDP中表達(dá)高于CNE2, siRNA下調(diào)keratin1表達(dá)后,可以顯著性減少鼻咽癌細(xì)胞株對(duì)五種化療藥物的IC50值,增加鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；當(dāng)siRNA下調(diào)keratin1表達(dá)后,多藥耐藥蛋白(MRP)的表達(dá)也下調(diào),說(shuō)明keratin1表達(dá)與MRP表達(dá)具有相關(guān)性；keratin1表達(dá)下調(diào)引起鼻咽癌細(xì)胞中MRP表達(dá)下調(diào),從而引起鼻咽癌細(xì)胞的耐藥性降低。結(jié)論：1.2-DE結(jié)合質(zhì)譜獲得了鼻咽癌順鉑耐藥的差異蛋白表達(dá)譜；2.獲得了17個(gè)與鼻咽癌順鉑耐藥有關(guān)的差異表達(dá)蛋白,這些蛋白功能涉及到細(xì)胞骨架、基因組穩(wěn)定、分子伴侶、代謝相關(guān)酶、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)信號(hào)通路、蛋白合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路等；3.KRT1,CTSD,ANXA5經(jīng)驗(yàn)證與鼻咽癌順鉑耐藥有關(guān)；4. KRT1表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞株對(duì)順鉑、長(zhǎng)春新堿、卡鉑、紫杉醇、5-FU的耐藥性減低；降低KRT1可導(dǎo)致化療藥物的耐藥性降低；5.鼻咽癌順鉑耐藥的分子機(jī)制可能與KRT1通過(guò)下調(diào)MRP表達(dá)有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 謝宗佑,孫保存,郝希山;大腸癌組織蛋白酶D表達(dá)與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2004年01期

2 姜潤(rùn)德,張立新,岳文,朱運(yùn)峰,路浩軍,劉昕,岑信棠,關(guān)新元,李春海;人鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系(CNE2/DDP)的建立及耐藥相關(guān)基因的篩選[J];癌癥;2003年04期

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本文編號(hào)：2313894