【摘要】：目的角膜堿燒傷是常見(jiàn)的、治療較為棘手的角膜外傷,堿燒傷后不同的臨床階段,組織反應(yīng)不同。急性期以炎癥反應(yīng)為特征,早期修復(fù)期以上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)為主;目前臨床上治療堿燒傷多采用抗炎、抑制免疫反應(yīng)、角膜移植等方法,但療效不甚理想。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs)是一種具有高度自我更新能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性的成體干細(xì)胞。BMSCs能夠合成分泌多種細(xì)胞因子,并可通過(guò)旁分泌效應(yīng)促進(jìn)受損細(xì)胞或組織修復(fù)。目前國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證明BMSCs能夠促進(jìn)堿燒傷后角膜修復(fù),但由其分泌的細(xì)胞因子的治療作用,尚待進(jìn)一步研究證明。本課題通過(guò)建立大鼠角膜堿燒傷模型,探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液(Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium MSC-CM)在堿燒傷后角膜上皮愈合、角膜混濁程度、組織炎癥反應(yīng)、基質(zhì)纖維化、細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。方法1.建立大鼠角膜堿燒傷模型:將直徑4mm的單層濾紙片在1mol/L NaOH溶液中浸泡后,貼附于角膜中央10秒,損傷后治療組給予MSC-CM局部點(diǎn)眼,對(duì)照組給予磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffer Saline PBS)點(diǎn)眼,大鼠飼養(yǎng)周期為14天,比較不同時(shí)間點(diǎn)兩組角膜修復(fù)情況;2.裂隙燈觀察堿燒傷后大鼠眼表的變化情況:分別于堿燒傷后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天、10天、14天,觀察角膜上皮愈合情況,并計(jì)算上皮缺損面積百分比(熒光素鈉染色,鈷藍(lán)光下觀察);分別于堿燒傷后48小時(shí)、3天、5天、7天、10天、14天,觀察中央角膜混濁度,并根據(jù)Fantes評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分;3.組織病理學(xué)檢查:分別于堿燒傷后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、3天、7天、14天,通過(guò)HE染色觀察損傷后角膜組織形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況;分別于堿燒傷后24小時(shí)、48小時(shí)、3天、7天、14天,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色,觀察堿燒傷后大鼠角膜細(xì)胞增殖(PCNA)、基質(zhì)纖維化(α-SMA)及細(xì)胞凋亡(Caspase-3)情況,并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù);4.實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR):分別于堿燒傷后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、3天、7天、14天,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-10)、基質(zhì)纖維化因子(α-SMA、Collage-Ⅲ、Collage-Ⅰ)、細(xì)胞增殖因子(PCNA)、細(xì)胞凋亡因子(Bax、Bcl_2、Caspase-3)的基因表達(dá)情況。結(jié)果1.堿燒傷后24小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天,MSC-CM治療組角膜上皮缺損面積百分比小于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MSC-CM治療組角膜上皮于損傷后第7天完全愈合,PBS對(duì)照組角膜上皮于損傷后第10天完全愈合;堿燒傷后48小時(shí)、3天、5天、7天、10天,兩組角膜混濁度評(píng)分比較,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MSC-CM治療組于損傷后第10天角膜完全透明,PBS對(duì)照組于損傷后第14天角膜完全透明;2. HE染色結(jié)果:堿燒傷后24小時(shí)、48小時(shí)、3天、7天,MSC-CM治療組角膜上皮細(xì)胞層數(shù),基質(zhì)水腫程度,膠原纖維排列規(guī)整程度均優(yōu)于PBS對(duì)照組,基質(zhì)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)均少于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:堿燒傷后24小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天,PCNA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)MSC-CM治療組均多于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);堿燒傷后24小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天、14天,α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)MSC-CM治療組均少于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);堿燒傷后4小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天,Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)MSC-CM治療組均少于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4. RT-PCR結(jié)果:堿燒傷后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、3天、7天,MSC-CM治療組 TNF-α (P0.01)、IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-Ⅲ(P0.01)、Bax (P0.01)、Caspase-3 (P0. 001)基因表達(dá)水平低于 PBS對(duì)照組,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)、Bcl_2(P0.01)基因表達(dá)水平高于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。堿燒傷后第14天,MSC-CM治療組TNF-α、Bax、Caspase-3、Bc12基因表達(dá)水平與PBS對(duì)照組比較,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-111 (P0.01)基因表達(dá)水平仍低于 PBS 對(duì)照組,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)基因表達(dá)水平仍高于PBS對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1. MSC-CM能夠促進(jìn)堿燒傷后角膜上皮修復(fù),加快上皮愈合速度;2. MSC-CM能抑制堿燒傷后角膜組織的炎癥反應(yīng),這可能與其能夠抑制炎癥因子TNF-α和IL-6基因表達(dá),同時(shí)促進(jìn)抗炎因子IL-10基因表達(dá)有關(guān);3. MSC-CM能抑制堿燒傷后角膜基質(zhì)纖維化,這可能與其能夠抑制α-SMA和Collagen-Ⅲ基因和蛋白表達(dá),同時(shí)促進(jìn)Collagen-Ⅰ基因表達(dá)有關(guān);4. MSC-CM能夠抑制堿燒傷后角膜細(xì)胞凋亡,這可能與其能夠促進(jìn)凋亡抑制基因Bc12基因表達(dá),并抑制凋亡誘導(dǎo)基因Bax、Caspase-3基因/蛋白表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R779.1

【參考文獻(xiàn)】

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2 黃科昌;楚云超;鄭觀榮;李娜;王德偉;劉偉偉;;caspase-3在多塞平誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用[J];中華麻醉學(xué)雜志;2016年01期

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本文編號(hào)：2306590