【摘要】：第一部分D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層擬老化大鼠模型的建立 目的：D-半乳糖誘導(dǎo)的Sprague-Dawley (SD)大鼠聽皮層擬老化模型的建立。方法：2個(gè)月齡SD雄性大鼠162只,隨機(jī)分為對照組和擬老化組：其中擬老化組大鼠給予頸背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖,連續(xù)8周；對照組大鼠頸背部皮下注射等體積生理鹽水,連續(xù)8周。造模結(jié)束后,擬老化組和對照組各分為三個(gè)年齡亞組：4個(gè)月齡組(即造模完成后0個(gè)月)、10個(gè)月齡組(即造模完成后6個(gè)月)和16個(gè)月組(即造模完成后12個(gè)月)。每個(gè)亞組27只SD大鼠。完成造模后,檢測每只大鼠聽性腦干反應(yīng)(Auditory Brainstem Response, ABR);酶標(biāo)儀比色法檢測總超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)的變化以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值(Glutathione:Oxidant glutathione,GGSH:GSSG)的變化；高效液相色譜分析法和酶標(biāo)儀比色法檢測丙二醛(Malondialdehyde, MDA)濃度的變化；實(shí)時(shí)定量PCR檢測聽皮層線粒體DNA (Mitochondrial DNA,mtDNA)常見缺失(Commen Deletion,CD)的變化；通過甲苯胺藍(lán)染色來檢測聽皮層組織細(xì)胞數(shù)量變化；通過透射電鏡(Transmission electron microscopy, TEM)來檢測大鼠聽皮層組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；通過原位末端標(biāo)記法(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Nick-End-Labelling TUNEL)來觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：ABR結(jié)果示在4月齡,10月齡,16月齡時(shí),相同頻率(4kHz、8kHz、16kHz,24kHz、32kHz)擬老化組和對照組比較,閾值變化不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);比色法結(jié)果示：與對照組相比,10月齡與16月齡擬老化組大鼠聽皮層SOD活性降低(P0.01),GSH:GSSG比值降低(P0.05)；比色法與高效液相色譜法顯示,擬老化組MDA濃度明顯增加(P0.05)；甲苯胺藍(lán)染色示,擬老化組大鼠聽皮層組織神經(jīng)元與同月齡對照組相比數(shù)量降低,16月齡時(shí),變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；電鏡檢測結(jié)果顯示,同月齡的擬老化組與對照組大鼠相比神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變、線粒體腫脹、脂褐素沉積、染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核變形等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變更為明顯且出現(xiàn)時(shí)間更早；TUNE染色結(jié)果顯示,擬老化組大鼠聽皮層細(xì)胞凋亡數(shù)目與同月齡的對照組大鼠相比,10月齡和16月齡細(xì)胞凋亡數(shù)目增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論：高劑量D-半乳糖導(dǎo)致聽皮層抗氧化酶活性降低、氧化應(yīng)激增加、mtDNACD蓄積、神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變明顯、神經(jīng)元密度下降、凋亡數(shù)目增多,促進(jìn)了大鼠聽皮層組織的衰老過程。 第二部分探討線粒體抗氧化酶Trx2在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層早衰中的作用 目的：我國社會老齡化趨勢日益明顯,在困擾老年人健康的慢性疾病中,老年性聾已躋身于第三位,僅次于高血壓與關(guān)節(jié)炎。老年性聾是影響老年人生活質(zhì)量的主要疾病之一,有研究表明老年性聾與氧化應(yīng)激密切相關(guān),然而老年性聾的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。硫氧還蛋白2(Thioredoxin2,Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白,它在抗氧化應(yīng)激、阻止線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著不可忽略的作用。本項(xiàng)研究意在探討Trx2在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層擬老化中的可能的作用機(jī)制。 方法：2個(gè)月齡SD雄性大鼠114隨機(jī)分為對照組和擬老化組：其中擬老化組大鼠給予頸背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖,連續(xù)8周；對照組大鼠頸背部皮下注射等體積生理鹽水,連續(xù)8周。造模結(jié)束后,擬老化組和對照組各分為三個(gè)年齡亞組：4個(gè)月齡組(即造模完成后0個(gè)月)、10個(gè)月齡組(即造模完成后6個(gè)月)和16個(gè)月組(即造模完成后12個(gè)月)。RT-PCR檢測硫氧還蛋白2(Thiredoxin2,Trx2),硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP)和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(Apoptosis Signal Regulating Kinase1, ASK1) mRNA表達(dá);western blot檢測Trx2,TXNIP和ASK1蛋白表達(dá)；western blot檢測ASK1活性變化；免疫共沉淀檢測Trx2-TXNIP及Trx2-ASK1復(fù)合體的變化；免疫熒光技術(shù)檢測Trx2和ASK1在聽皮層組織的表達(dá)及定位；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TXNIP在聽皮層組織的表達(dá)及定位。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組相比,擬老化組大鼠Trx2mRNA水平在4月齡,10月齡和16月齡分別下降了1.16-,1.40-(P0.01),和1.45-倍(P0.01),TXNIP mRNA水平分別上升了1.39-(P0.05),1.40-(P0.01),和1.50-倍(P0.05),ASK1mRNA水平分別上升了1.18-,1.25-(P0.01),和1.26-倍(P0.01)；在對照組,16月齡大鼠與4月齡大鼠相比,Trx2mRNA水平降低了1.29倍(P0.05),而TXNIP與ASK1mRNA水平分別升高了1.59-(P0.05)和1.12-倍。在擬老化組,16月齡大鼠與4月齡大鼠相比,Trx2mRNA水平降低了1.29倍(P0.05),而TXNIP與ASK1mRNA水平分別升高了1.71倍(P0.01)和1.42倍。Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比,擬老化組大鼠在4月齡,10月齡和16月齡中Trx2水平分別降低1.50-,1.61-(P0.05)和1.56-倍(P0.05),TXNIP水平分別上升了1.34-(P0.05),1.44-(P0.05),和1.57-倍(P0.05),ASK1水平分別上升了1.15-,2.19-(P0.01)和2.17-倍(P0.01)；我們的western blot結(jié)果還顯示,在對照組和擬老化組,Trx2蛋白隨著年齡的增長而降低,而TXNIP和ASK1蛋白水平隨年齡的增長而升高。在對照組中,16月齡與4月齡相比,Trx2蛋白下降1.54倍,TXNIP蛋白上升1.42倍(P0.05), ASK1蛋白上升1.59倍。在擬老化組中,16月齡與4月齡相比,Trx2蛋白下降1.77倍(P0.01)倍,TXNIP蛋白上升2.30-倍(P0.01), ASK1蛋白上升1.75-倍(P0.05)。此外,ASK1活性在擬老化組明顯增加,并且隨著年齡的增長而增加(P0.01)。免疫沉淀結(jié)果顯示：[rx2-TXNIP和Trx2-ASK1復(fù)合體僅存在于線粒體,并且與對照組相比,4月齡,10月齡和16月齡擬老化組Trx2-TXNIP復(fù)合體分別增加了1.63-(P0.05),1.21-(P0.05)和1.26-倍(P0.01),而Trx2-ASK1復(fù)合體分別降低了1.09-(P0.05),1.48-(P0.01)和1.37-倍(P0.05)。與此同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),Trx2-TXNIP復(fù)合體隨年齡的增加而增多,但Trx2-ASK1復(fù)合體隨年齡的增加而減少。在對照組,16月齡大鼠與4月齡大鼠相比,Trx2-TXNIP復(fù)合體增加了2.38倍(P0.01)而Trx2-ASK1復(fù)合體降低了2.61倍(P0.01)。在擬老化組,16月齡大鼠與4月齡大鼠相比,Trx2-TXNIP復(fù)合體增加了2.99倍(P0.01)而Trx2-ASK1復(fù)合體降低了2.01(P0.01)倍。 結(jié)論：聽皮層Trx2的下降和TXNIP-Trx2-ASK1信號通路的改變導(dǎo)致聽皮層抵抗氧化應(yīng)激能力下降,進(jìn)而導(dǎo)致ROS生成增加,神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變以及氧化應(yīng)激累積,線粒體功能障礙和異常增多的細(xì)胞凋亡。這些變化促使老年性聾的出現(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43

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本文編號：2292071