發(fā)布時(shí)間：2018-08-03 10:39

【摘要】：目的： 以過(guò)氧化氫損傷HLE B-3細(xì)胞為氧化應(yīng)激損傷的模型，觀察氯通道阻斷劑DIDS和NPPB對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3損傷的影響,并通過(guò)細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的角度初步探討氯通道阻斷劑對(duì)氧化應(yīng)激下HLE B-3保護(hù)的作用途徑及其相關(guān)的分子機(jī)制。 材料和方法： 1. Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實(shí)現(xiàn)時(shí)滯拍攝固定視野內(nèi)活細(xì)胞圖像分析HLE B-3在低滲刺激下細(xì)胞容積的改變，并通過(guò)細(xì)胞外溶液氯離子置換和氯通道阻斷劑干預(yù)的方式闡明氯通道在RVD中所起到的作用。 2. HLE-B3氧化應(yīng)激損傷模型的建立及氯通道阻斷劑保護(hù)作用的觀察，外源性500μmol/L過(guò)氧化氫（H2O2）作用于HLE B-3細(xì)胞，細(xì)胞外溶液氯離子置換及氯通道阻斷劑（NPPB、DIDS）梯度濃度作用于氧化應(yīng)激下HLE B-3細(xì)胞，通過(guò)光鏡和吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及和核形態(tài)改變、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 3.觀察氧化應(yīng)激下HLE B-3細(xì)胞凋亡及凋亡性細(xì)胞回縮的變化和氯通道阻斷劑（NPPB、DIDS）干預(yù)的影響。在500μmol/L H2O2作用于HLE B-3細(xì)胞的6h內(nèi)，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存力，Caspase-3活性檢測(cè)及Western Blot法檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平、DNA瓊脂糖電泳分析、和Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實(shí)現(xiàn)時(shí)滯拍攝固定視野內(nèi)活細(xì)胞圖像，分析細(xì)胞凋亡、Caspase-3表達(dá)變化及細(xì)胞容積的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果： 1.在低滲細(xì)胞外灌流液作用下，HLE B-3細(xì)胞的容積脹大且呈滲透壓相關(guān)性，同時(shí)調(diào)節(jié)性容積回縮（RVD）能力增強(qiáng)。通過(guò)硝酸根離子取代灌流液中的氯離子方式耗竭細(xì)胞內(nèi)氯離子，這時(shí)觀察到RVD消失，而用氯通道阻斷劑也可以得到相似結(jié)果。 2.采用不同濃度的氯通道阻斷劑NPPB或DIDS干預(yù)下，細(xì)胞存活率呈藥物劑量依賴性升高，其中100μmol/L，200μmol/L這兩個(gè)濃度NPPB和DIDS干預(yù)組細(xì)胞存活率與H2O2處理組相比較，差異存在顯著性（n＝5，P0.01）。氯通道阻斷劑NPPB(100mol/L)及DIDS(100mol/L)皆可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞凋亡及細(xì)胞容積減少，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞6h后，測(cè)得細(xì)胞凋亡率為（72.06士2.73）%，加用NPPB及DIDS后，，凋亡率則將為（20.78士2.62）%和（15.83士2.57）%。 3.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡早期即可觀察到細(xì)胞容積減小。在連續(xù)觀察的6h中，細(xì)胞容積逐漸減小，6h末細(xì)胞容積減少(26.98士2.35)%。氯通道阻斷劑NPPB(100moL/L)及DIDS(100moL/L)顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)性容積減小，分別為(6.81士0.57)%和(7.03士0.67)％。 結(jié)論： 1. Cl是HLE B-3細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮（RVD）的關(guān)鍵性離子，Cl分泌是實(shí)現(xiàn)RVD的關(guān)鍵因素，氯通道阻斷劑阻斷氯通道，幾乎完全或大部分阻斷RVD，表明氯通道開(kāi)放是HLE B-3細(xì)胞分泌Cl，實(shí)現(xiàn)RVD的關(guān)鍵途徑。 2.氯通道阻斷劑NPPB和DIDS對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中的異常的容積回縮有關(guān)。 3.氯通道介導(dǎo)的凋亡相關(guān)性細(xì)胞容積回縮發(fā)生是一個(gè)早于Caspase-3活性增強(qiáng)及DNA斷裂的細(xì)胞凋亡事件。氯通道參與H2O2誘導(dǎo)的HLE B-3細(xì)胞凋亡，機(jī)制與其介導(dǎo)凋亡性容積回縮有關(guān)。
[Abstract]:Objective:
The effects of chlorine channel blocker DIDS and NPPB on the HLE-B3 damage of lens epithelial cells induced by oxidative stress were observed with the damage of hydrogen peroxide damaged HLE B-3 cells as oxidative stress. The pathway of the action of chlorine channel blocker to HLE B-3 protection under oxidative stress and the related points were preliminarily discussed. Submechanism.
Materials and methods:
Under the control of 1. Image-Pro Plus6.0 image analysis software, the changes in the cell volume of HLE B-3 under the low permeability stimulation were realized by the live cell image analysis in the fixed field of vision with time delay shooting, and the role of the chloride channel in RVD was clarified by the way of chlorine ion replacement and the intervention of chlorine channel blockers.
2. HLE-B3 oxidative stress damage model and the observation of the protective effect of chloride channel blocker, exogenous 500 mol/L hydrogen peroxide (H2O2) acts on HLE B-3 cells, chlorine ion replacement and chloride channel blocker (NPPB, DIDS) gradient concentration on HLE B-3 cells under oxidative stress, through light microscopy and acridine orange / ethidium bromide (AO/E). B) Cell morphology and nuclear morphology were observed by fluorescence staining, cell viability was detected by MTT assay, and apoptosis rate was detected by flow cytometry.
3. the changes of apoptosis and apoptotic cell retracting of HLE B-3 cells and the effect of NPPB (DIDS) were observed under oxidative stress. Cell viability was detected by MTT method in 6h of HLE B-3 cells in 500 mu mol/L H2O2, and Caspase-3 activity detection and Western assay were used to detect the expression level. Agarose electrophoresis analysis was used. Under the control of the Image-Pro Plus6.0 image analysis software, the living cell image in the fixed field of vision was photographed, and the apoptosis, the change of Caspase-3 expression and the dynamic change of cell volume were analyzed.
Result:
1. under the action of hypotonic external perfusion fluid, the volume of HLE B-3 cells is swollen and osmotic pressure is related, and the capacity of regulatory volume retracting (RVD) is enhanced. The chloride ion in the cells is depleted by the substitution of nitrate ions in the perfusion solution, then the RVD disappears, and the chlorine channel blocker can also be used to obtain similar results.
2. under the intervention of different concentration of chloride channel blockers NPPB or DIDS, the cell survival rate was increased in dose dependence, including 100 mol/L and 200 mol/L, the two concentrations of NPPB and DIDS intervention group were compared with H2O2 treatment group, the difference was significant (n = 5, P0.01). Chlorine channel blocker NPPB (100mol/L) and DIDS ( The apoptosis of HLE-B3 cells induced by H2O2 and the decrease of cell volume were significantly inhibited. The apoptosis rate was (72.06 2.73)% after oxidative stress induced 6h, and the rate of apoptosis was (20.78 and 2.62)% and (15.83 SW 2.57) after NPPB and DIDS were added.
Cell volume decreased at the early stage of apoptosis induced by 3. oxidative stress. Cell volume decreased gradually and the volume of terminal 6h cells decreased (26.98 2.35) in the continuous observation of 6h. Chloride channel blocker NPPB (100moL/L) and DIDS (100moL/L) significantly inhibited the apoptosis related volume of oxidative stress induced by (6.81 and 0.57)%, respectively. (7.03 and 0.67).
Conclusion:
1. Cl is the key ion of regulatory volume retracting (RVD) in HLE B-3 cells. Cl secretion is the key factor for the realization of RVD. Chlorine channel blockers block the chloride channel, almost completely or most of the blocking of RVD, indicating that the opening of the chloride channel is the key way for HLE B-3 cells to secrete Cl and realize RVD.
2. chloride channel blockers, NPPB and DIDS, have obvious protective effects on oxidative stress induced HLE-B3 cell apoptosis, and the mechanism may be related to the abnormal volume retraction in the process of inhibiting apoptosis.
The apoptosis related cell volume retraction mediated by 3. chloride channel is a cell apoptosis event earlier than Caspase-3 activity enhancement and DNA fracture. The chloride channel is involved in the apoptosis of HLE B-3 cells induced by H2O2, which is related to the apoptosis induced volume retraction.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R776

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本文編號(hào)：2161486