本文選題：鼻咽癌 + 醛酮還原酶家族成員1B10�。� 參考：《暨南大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是好發(fā)于我國(guó)南方及東南亞地區(qū)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其年發(fā)病率在30～80/10萬(wàn),尤其以廣東為甚。臨床上鼻咽癌以高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)和低分化為顯著特征,將近88.0%的鼻咽癌患者初診時(shí)已有頸部淋巴轉(zhuǎn)移,頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被視為鼻咽癌發(fā)病的顯著特征之一。鼻咽癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,EB病毒感染及其他多種非病毒因素(如化學(xué)致促癌物)參與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。新近研究發(fā)現(xiàn),醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10,Aldo-keto reductase 1B10)在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用,但AKR1B10參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)理仍不清楚。二亞硝基哌嗪(DNP,N,N'-Dinitrosopiperazine)是鼻咽癌非病毒因素(如化學(xué)致促癌物)的致病因子之一。前期研究發(fā)現(xiàn),DNP通過(guò)活化多個(gè)信號(hào)分子,促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移,AKR1B10是其中的一個(gè)重要分子,推斷DNP可以介導(dǎo)AKR1B10表達(dá)參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移。本文首先采用免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附的方法,分析了 AKR1B10在鼻咽癌組織和血清中的表達(dá)情況,從組織和血清學(xué)的層面明確AKR1B10表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。然后,應(yīng)用分子克隆技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、基因干擾技術(shù)、Real-time PCR技術(shù)和Western Blotting技術(shù)等探討DNP對(duì)鼻咽癌細(xì)胞AKR1B10表達(dá)的影響,明確DNP上調(diào)AKR1B10表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。最后,從細(xì)胞生物學(xué)功能角度進(jìn)行研究,采用克隆形成試驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲試驗(yàn)等考察DNP通過(guò)介導(dǎo)AKR1B10表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能和行為的影響,從而闡明DNP可以誘導(dǎo)AKR1B10表達(dá)參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為探討鼻咽癌高轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理以及鼻咽癌篩查診斷的血清標(biāo)志物、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和靶向治療候選分子的篩選提供有價(jià)值的參考和依據(jù)。方法:(1)免疫組化檢測(cè)鼻咽癌患者原發(fā)部位和有淋巴轉(zhuǎn)移組織中AKR1B10蛋白表達(dá)水平,分析組織中的AKR1B10表達(dá)水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的關(guān)系。(2)ELISA法檢測(cè)鼻咽癌無(wú)轉(zhuǎn)移和有轉(zhuǎn)移患者血清中AKR1B10的表達(dá)水平,明確AKR1B10血清學(xué)水平與臨床鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。(3)用不同濃度DNP處理6-10B和5-8F細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)分析DNP對(duì)6-10B和5-8F細(xì)胞的非毒性濃度(NCC)和時(shí)效關(guān)系,確定DNP非毒性濃度。(4)分析DNP處理組和對(duì)照組細(xì)胞AKR1B10蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,明確DNP誘導(dǎo)AKR1B10表達(dá)。(5)應(yīng)用分子克隆技術(shù),構(gòu)建AKR1B10過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-AKRlB10,為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。(6)將過(guò)表達(dá)載體pcDNA 3.1-AKR1B10轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞,篩選穩(wěn)定克隆株。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞株,檢測(cè)對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組之間AKR1B10蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,明確AKR1B10高表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。(7)細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)、Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)分析DNP誘導(dǎo)AKR1B10表達(dá)對(duì)6-10B和5-8F細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,明確DNP是否促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲。(8)采用siRNA干擾技術(shù)阻斷6-10B和5-8F細(xì)胞AKR1B10的表達(dá),分析DNP在AKR1B10表達(dá)被干擾后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力的影響,明確DNP通過(guò)介導(dǎo)AKR1B10表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。(9)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,選用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果:(1)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了 20例正常鼻咽黏膜上皮組織(NNET)、20例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織(NPC,AJCC/UICC 2009分期)、30例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織(LMNPC)中AKR1B10表達(dá)。結(jié)果顯示AKR1B10在NNET、NPC及 LMNPC 組織的陽(yáng)性率分別為 10.0%(2/20)、85.0%(17/20)、93.3%(28/30);AKR1B10在鼻咽癌中的表達(dá)明顯高于正常鼻咽組織(P0.05),并且LMNPC組織中的表達(dá)高于無(wú)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織,二者比較有差別意義(P0.05),提示AKR1B10表達(dá)升高與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有關(guān),其表達(dá)上調(diào)與臨床鼻咽癌發(fā)展轉(zhuǎn)移正相關(guān)。(2)ELISA法檢測(cè)鼻咽癌患者血清中AKR1B10水平,考察并明確血清AKR1B10水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。第一部分檢測(cè)了 30例健康對(duì)照組、8例鼻咽炎癥組、71例鼻咽癌組(不分期)血清中AKR1B10的表達(dá)情況,結(jié)果顯示AKR1B10在健康對(duì)照組、鼻咽炎癥組、鼻咽癌組中的中位數(shù)濃度分別為:62.73 ng/L、408.01 ng/L、603.52 ng/L。AKR1B10 在鼻咽癌和鼻咽炎癥患者血清中均有表達(dá)升高,并且鼻咽癌組明顯高于健康對(duì)照組和鼻咽炎癥組(P0.05),提示AKR1B10血清水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。第二部分檢測(cè)了70例有明確臨床分期(AJCC/UICC 2009分期)鼻咽癌患者血清標(biāo)本中AKR1B10,其中無(wú)轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者3例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者59例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者8例。三組血清AKR1B10的中位數(shù)濃度分別為:287.16 ng/L、482.08 ng/L、5878.21 ng/L,三組之間存在顯著差異(P0.05)。結(jié)果提示,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者AKR1B10的表達(dá)明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移和僅淋巴轉(zhuǎn)移的病例(P0.05),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于非轉(zhuǎn)移組(P0.05),提示AKR1B10血清學(xué)水平與臨床鼻咽癌轉(zhuǎn)移正相關(guān),可以作為預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的血清學(xué)候選標(biāo)志物。(3)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DNP在0～100μmol/L時(shí),對(duì)6-10B細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響(P0.05);在150μmol/L以上時(shí),DNP對(duì)6-10B細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有明顯的抑制作用,表現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)(P0.05)。0～100μmol/L是DNP處理6-10B細(xì)胞的非毒性濃度,而DNP對(duì)5-8F細(xì)胞的非毒性濃度則為0～150μmol/L,后續(xù)研究工作以100μmol/L作為DNP工作濃度。(4)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DNP處理組和對(duì)照組之間AKR1B10蛋白質(zhì)表達(dá)和克隆形成數(shù)均存在差異,DNP處理組AKR1B10蛋白質(zhì)表達(dá)高于對(duì)照組,克隆形成數(shù)也是DNP處理組多于對(duì)照組。(5)應(yīng)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了 AKR1B10過(guò)表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)-AKR1B10。將表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)-AKR1B10 轉(zhuǎn)染 6-10B 細(xì)胞,Western Blotting分析顯示對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組之間AKR1B10蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異(P0.05)。(6)Western Blotting分析DNP處理鼻咽癌細(xì)胞后AKR1B10的表達(dá)變化,結(jié)果表明用不同濃度的DNP處理6-10B細(xì)胞,AKR1B10的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P0.05),呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。(7)克隆形成、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分析DNP對(duì)鼻咽癌細(xì)胞6-10B和5-8F遷移侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DNP對(duì)6-10B細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲能力起到明顯增強(qiáng)作用;且阻斷AKR1B10后,DNP誘導(dǎo)6-10B和5-8F細(xì)胞遷移侵襲的能力降低(P0.05)。(8)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:DNP介導(dǎo)6-1(B細(xì)胞AKR1B10表達(dá)以及5-8F細(xì)胞AKR1B10表達(dá),蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿。結(jié)論:(1)鼻咽癌組織和血清AKR1B10檢測(cè)表明,頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的AKR1B10表達(dá)水平明顯高于鼻咽癌未轉(zhuǎn)移組和正常對(duì)照組,提示AKR1B10表達(dá)上調(diào)與臨床鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān),可以作為鼻咽癌進(jìn)展和治療預(yù)后判斷的候選標(biāo)志物。(2)DNP通過(guò)介導(dǎo)AKR1B10高表達(dá),增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。提示DNP作為化學(xué)致癌劑可能是鼻咽癌高轉(zhuǎn)移重要的誘因之一。AKR1B10可能是鼻咽癌轉(zhuǎn)移中一個(gè)重要的信號(hào)分子。(3)通過(guò)克隆形成試驗(yàn)、Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)考察了DNP介導(dǎo)AKR1B10表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,從而闡明DNP可以通過(guò)介導(dǎo)AKR1B10表達(dá)參與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移。(4)應(yīng)用基因干擾技術(shù)、分子克隆技術(shù)、Real-time PCR技術(shù)以及Western Blotting等方法從基因和蛋白質(zhì)水平研究并驗(yàn)證了阻斷AKR1B10表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,提示AKR1B10可以作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療的靶分子。
[Abstract]:Objective : Nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) is one of the most common malignant tumors in the south of China and Southeast Asia , and its annual incidence is 30 锝，

本文編號(hào)：1898440