本文選題：Robo1 + Robo2��； 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：臨床上，視神經(jīng)損傷可由顱腦外傷、腫瘤壓迫、高眼壓、炎癥等原發(fā)病導(dǎo)致，是眼科以及神經(jīng)外科領(lǐng)域的常見疾病，常導(dǎo)致視力和視野的嚴(yán)重喪失，有的甚至失明，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，因此視神經(jīng)損傷修復(fù)的研究已經(jīng)成為神經(jīng)眼科學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)。Robo蛋白家族(Roundabout family)包括Robo1，Robo2，Robo3和Robo4等4個(gè)成員，是一類與神經(jīng)發(fā)育有一定關(guān)聯(lián)的保守跨膜蛋白家族。Robol，2，3主要在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，具有調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞遷移和神經(jīng)軸突延伸的作用。2002年，Robo4，亦稱MRB(magic roundabout)，被Huminiecki等研究人員率先發(fā)現(xiàn)。這一蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面，尤其是在血管生成活躍的樣本中有特異性表達(dá)，對抑制病理性新生血管形成，降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性有一定作用。Slit蛋白屬于分泌性蛋白質(zhì)，作為配體與Robo蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。通過查閱相關(guān)大量文獻(xiàn)，對Slit-Robo信號系統(tǒng)在視網(wǎng)膜上的研究多集中于胚胎鼠及出生后21天內(nèi)的新生鼠，對成年大鼠視網(wǎng)膜是否有Robo蛋白表達(dá)及定位，以及在缺氧條件下Slit-Robo信號系統(tǒng)是否發(fā)揮保護(hù)作用鮮有報(bào)導(dǎo)。 中樞系統(tǒng)神經(jīng)中線附近，Slit蛋白的合成主要完成于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，也可由神經(jīng)元自分泌產(chǎn)生。如果在發(fā)育過程中Slit不足，在中線附近可觀察到由交叉神經(jīng)元軸突和縱行神經(jīng)元軸突異常聚集而形成的巨大的神經(jīng)束。Seeger等研究人員報(bào)導(dǎo)，正常發(fā)育過程中不應(yīng)跨過中線的軸突在Robo1突變體中會(huì)反復(fù)跨越中線。此外，Marillat研究組對Slit2及其受體Robo1，Robo2在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了深入研究后發(fā)現(xiàn)，Robo家族的表達(dá)模式呈高度有序。從原位雜交結(jié)果分析，在長距離的投射結(jié)構(gòu)中，這一特點(diǎn)尤為明顯。例如，Robo2的表達(dá)與發(fā)育中的軀體感覺以及視覺、聽覺、嗅覺等關(guān)系密切。在神經(jīng)發(fā)育的一些關(guān)鍵時(shí)期，比如感覺軸突長出向中樞尋路階段，在中樞中與感覺相關(guān)的各個(gè)接遞站點(diǎn)中，Robo2都有固有表達(dá)。據(jù)Rajagopala報(bào)導(dǎo)，Slit1、2和3在果蠅的神經(jīng)發(fā)育過程中均表達(dá)于中線，而Robo1、2和3在這一過程中也在神經(jīng)元軸突上表達(dá)，后者通過與配體Slit結(jié)合，從而發(fā)揮排斥信號作用。根據(jù)Robo1、2、3在軸突上的表達(dá)情況，軸突可以分為內(nèi)側(cè)、中間、外側(cè)三個(gè)平行的束：內(nèi)側(cè)束僅表達(dá)Robo1蛋白；中間束表達(dá)Robo1和Robo3蛋白；外側(cè)束則表達(dá)全部上述三種Robo蛋白。而在病理情況下，上述三種Robo蛋白中任何一種蛋白的突變，都會(huì)使所在軸突脫離原本從屬的神經(jīng)束。例如，中間束的軸突中若存在Robo3突變，該軸突就會(huì)遷移至偏向內(nèi)側(cè)束的位置完成發(fā)育。此外，在三叉神經(jīng)軸突的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)若以Slit2與軸突進(jìn)行接觸，會(huì)促進(jìn)軸突末端分支的增多，甚至形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，Slitl蛋白對于皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育有促進(jìn)作用，尤其在樹突結(jié)構(gòu)的分支化過程以及生長中尤為明顯。Wong等在體外實(shí)驗(yàn)中切斷了坐骨神經(jīng)，3天后在感覺神經(jīng)元內(nèi)測得了Robo2蛋白表達(dá)增加。這一增多趨勢在7天后達(dá)到高峰，并在此水平保持1周左右，直至3～4周后，Robo2的表達(dá)水平才恢復(fù)正常。依據(jù)這些研究結(jié)果，Robo2蛋白在神經(jīng)元受損后表達(dá)增加，提示其可能參與到了與感覺突觸再生調(diào)控有關(guān)的過程當(dāng)中。而在Madura的實(shí)驗(yàn)中，面神經(jīng)核經(jīng)過軸索顯微外科技術(shù)橫斷處理后，從術(shù)后第3天起，直至第28天，斷端處運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Robo1和Robo2的mRNA表達(dá)量顯著持續(xù)上升；同時(shí)，在橫斷處理后7-35天期間，肌肉神經(jīng)發(fā)生了再生，提示Robo蛋白家族在軸突修復(fù)方面的可能潛能。而在Altay等的研究中，研究者首先成功誘導(dǎo)雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞，導(dǎo)致大腦彌漫性缺血，而后在Slit的功能分析中發(fā)現(xiàn)，Slit能有效減少遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，特別對海馬區(qū)CAI椎體細(xì)胞尤為明顯。另外Slit可以阻止組織缺氧缺糖后再重新恢復(fù)氧合指標(biāo)及血糖指標(biāo)這一過程中帶來的組織損傷。因此Slit-robo信號系統(tǒng)在胚胎時(shí)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，以及神經(jīng)元損傷修復(fù)過程中起到重要信號調(diào)節(jié)作用。但是該信號系統(tǒng)在成年大鼠視網(wǎng)膜上表達(dá)情況，以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能損傷時(shí)，是否發(fā)揮調(diào)節(jié)保護(hù)作用尚不明確。 本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分首先選取Robo1和Robo2蛋白作為檢測對象，通過特異性抗體，對正常條件下飼養(yǎng)的成年SD大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Robo1和Robo2蛋白強(qiáng)表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維層，在內(nèi)核層及光感受器層也有少量表達(dá)，恰好與視網(wǎng)膜三級神經(jīng)元傳遞信號的特點(diǎn)相符合。為了驗(yàn)證在體內(nèi)缺氧條件下，Robo1和Robo2蛋白表達(dá)變化情況。我們選取健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常對照組（CON）20只和糖尿病組（DM）20只。正常對照組（CON）給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。糖尿病組（DM）給予配制的高脂顆粒飼料進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)6周后，給予STZ單次腹腔注射（35mg/kg，溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.5），制備2型糖尿病模型。STZ注射SD大鼠72小時(shí)后，通過尾靜脈采血測血糖，DM模型成功標(biāo)準(zhǔn)定為血糖濃度＞16.7mmol/L、尿糖3+～4+，并剔除未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。建模成功后8周，處死大鼠。利用RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Robo1和Robo2mRNA和蛋白表達(dá)變化情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常對照組大鼠相比，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Robo1和Robo2mRNA的表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.01）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與正常對照組大鼠相比，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Robo1和Robo2蛋白的表達(dá)均顯著增加，通過對蛋白表達(dá)的灰度分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Robo1蛋白表達(dá)增加了217.4%， Robo2蛋白的表達(dá)增加了470%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.01）。提示在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期發(fā)生過程中，Robo1和Robo2蛋白可能起到重要調(diào)節(jié)作用。 體外實(shí)驗(yàn)部分為了驗(yàn)證體外條件下，缺氧因素對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)Robo1和Robo2的影響，我們設(shè)計(jì)了利用三氣培養(yǎng)箱制造缺氧環(huán)境，將大鼠RGC-5細(xì)胞放入此環(huán)境中培養(yǎng)12h，24h，48h后取出，利用RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測RGC-5細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，缺氧條件下RGC-5細(xì)胞中Robo1和Robo2mRNA的表達(dá)顯著增加，，且隨著缺氧時(shí)間的延長，其表達(dá)逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.01）。免疫印跡結(jié)果進(jìn)一步顯示，缺氧環(huán)境下RGC-5細(xì)胞中Robo1和Robo2兩種蛋白的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，隨著缺氧時(shí)間的延長，兩種蛋白表達(dá)含量均顯著增高，通過對蛋白表達(dá)的灰度分析顯示，缺氧培養(yǎng)12h，24h，48h后，Robo1蛋白表達(dá)量分別增加2.17倍，3.01倍和8.25倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.01）。Robo2蛋白表達(dá)量分別增加了12倍，24倍和47倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.01）。證明缺氧條件下，RGC-5細(xì)胞上Robo1和Robo2蛋白表達(dá)會(huì)增多。 然后為了證明Slit-robo信號系統(tǒng)對成年大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，我們設(shè)計(jì)了利用RNA干擾靶向干涉RGC-5細(xì)胞中的Slit2、Robo1、Robo2，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測靶向干涉效率，同時(shí)利用免疫熒光染色檢測轉(zhuǎn)染后的RGC-5后細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，以及利用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測RGC-5細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果如下：DAPI染色顯示，與對照組相比，分別抑制Robo1，Robo2和Slit2表達(dá)后，RGC-5細(xì)胞核出現(xiàn)染色體固縮，部分細(xì)胞核呈顆粒狀等典型細(xì)胞凋亡形態(tài)。Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，與對照組相比，抑制Robo1，Robo2和Slit2表達(dá)后，RGC-5細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯顯著增多，由3.9%增加到28.48%、25.89%和20.62%。證明Slit-robo信號可以抑制成年大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)部分證明Robo1和Robo2蛋白主要存在于大鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維層。II型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Robo1和Robo2蛋白表達(dá)增多。體外缺氧條件下大鼠RGC-5細(xì)胞中的Robo1和Robo2表達(dá)增多，隨著缺氧時(shí)間的增加，蛋白表達(dá)量增加。siRNA干擾Slit-Robo信號通路蛋白的表達(dá)能夠增加體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率，Slit-Robo信號系統(tǒng)對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護(hù)作用。但Slit-robo信號系統(tǒng)具體如何發(fā)揮保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。
[Abstract]:In 2002 , Robo4 , Robo2 , Robo3 and Robo4 play a role in inhibiting pathological neovascularization and decreasing the permeability of endothelial cells .

According to Rajagopala , Slit2 and its receptor Robo1 and Robo2 were expressed in the middle line .
the middle beam expresses Robo1 and Robo3 protein ;
In the study of trigeminal neurites , the expression level of Robo2 protein increased after 7 days , and the expression level of Robo2 increased after 3 - 4 weeks .
At the same time , during 7 - 35 days after transection , the muscle nerve regeneration , suggesting the potential of the Robo protein family in axonal repair . In Altay et al . , the researchers first succeeded in inducing bilateral common carotid artery occlusion , leading to diffuse ischemia in the brain .

In order to verify the expression of Robo1 and Robo2 protein in diabetic rats , the levels of Robo1 and Robo2 in diabetic rats were significantly increased compared with normal control rats .

The expression levels of Robo1 and Robo2 in RGC - 5 cells were significantly increased by RT - PCR and Western - blot . The expression levels of Robo1 and Robo2 in RGC - 5 cells increased by 2 . 17 - fold , 3 . 01 - fold and 8 . 25 - fold respectively .

In order to demonstrate the protective effect on retinal ganglion cells of adult rats , we designed the expression of Slit2 , Robo1 , Robo2 in RGC - 5 cells by using RNA interference . The results showed that the apoptosis of RGC - 5 cells was significantly increased after the expression of Robo1 , Robo2 and Slit2 by immunofluorescence staining . The results showed that the number of apoptotic cells in RGC - 5 cells increased significantly from 3.9 % to 28.48 % , 25.89 % and 20.62 % respectively .

In conclusion , Robo1 and Robo2 proteins were mainly present in retinal ganglion cells and nerve fiber layers in rat retina . Robo1 and Robo2 expression increased in the retina of type II diabetic rats . The expression of Robo1 and Robo2 increased in rat RGC - 5 cells in vitro . The expression of Robo1 and Robo2 increased with the increase of hypoxia time .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陶德定,沈怡,馮曉瀾,陳漢平;CD71和Hoechst33258用于孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞的分選[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2000年05期

2 Jing Tan;Qing Zeng;Xian-Zheng Jiang;Le-Ye He;Jin-Rong Wang;Kun Yao;Chang-Hui Wang;;Apoptosis of bladder transitional cell carcinoma T24 cells induced by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfection[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年05期

3 Hong-Tao Yan;Guan-Fang Su;;Expression and significance of HIF-1α and VEGF in rats with diabetic retinopathy[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2014年03期

本文編號：1873703