發(fā)布時間：2018-04-11 01:35

  本文選題：自噬 + 細胞凋亡�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的：鼻咽癌是我國南方地區(qū)的高發(fā)腫瘤,其特殊的臨床解剖部位和生物學行為,使得放療被認為是首選的治療手段。近年來,隨著計算機技術的進步和加速器設備的升級,使得三維適形放射治療(3-dimensional conformal radiotherapy,3-DCRT)技術、調強適形放射治療(intensity modulated radiotherapy, IMRT)技術得以實現(xiàn)。3-DCRT技術可以實現(xiàn)放射劑量分布在空間三維方向上與腫瘤形狀一致,而IMRT不僅劑量分布與腫瘤形狀一致,而且劑量強度分布也可以調節(jié),這使得鼻咽癌的5年生存率大大提高,尤其是早期患者的5年生存率可達80%-90%。然而,臨床上仍有部分病人尤其是中晚期患者放療后出現(xiàn)局部殘留或局部復發(fā),其中腫瘤細胞在放療過程中的放射抗拒性是重要原因之一。自噬(autophagy)是一個古老的生物學現(xiàn)象,最早來源于希臘語,其字面意思是自我吞噬,廣泛存在于酵母和其它較低級生命體中,是生物降解胞內蛋白、完成細胞器轉化、保持內環(huán)境穩(wěn)定的重要方式,也是哺乳動物清除癌細胞的手段之一。近年來的研究顯示：自噬是不同于凋亡的另一種程序性細胞死亡,是長壽命蛋白和細胞器的代謝主要依靠途徑之一。在人類自噬過程中比較明確的和研究較多的是Beclin1基因和其編碼蛋白。自噬體形成必需的微管相關蛋白輕鏈3(MAPLC3)和p62蛋白也常常用于自噬的檢測。為了維持機體細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài),正常情況下細胞的自噬水平維持在一個較低的水平,當細胞受到一些外界刺激時便可以迅速上調,如：營養(yǎng)缺乏、生長激素缺乏、細胞結構重建、細胞內出現(xiàn)過多的受損細胞器或代謝廢物等。自噬過程主要受兩種營養(yǎng)感受器的調節(jié)：即mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)途徑依賴的自噬和不依賴mTOR途徑的自噬。TOR激酶(target of rapamycin(TOR)kinase)是氨基酸、ATP和激素的感受器,對細胞的分化生長具有重要調節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,發(fā)揮“門衛(wèi)(gate-keeper)"作用,在營養(yǎng)充分時關閉自噬信號。而真核起始因子2激酶Gcn2(eukaryoticinitiation factor2(eIF2)kinase Gcn2)及其下游靶位Gcn4——即自噬基因的轉錄反式作用子,在細胞營養(yǎng)缺乏時則啟動自噬信號。位于TOR激酶下游的主要是一些編碼自噬ATG蛋白的相關基因,參與自噬的發(fā)生、融合、成熟、再循環(huán)。雷帕霉素及其類似物是TOR受體的拮抗劑,因此能夠誘導自噬。另外,較常用的自噬抑制劑有氯喹(Chloroquine disphosphate)、二磷酸氯喹及3-甲基腺嘌呤(3MA)等。自噬在腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展和治療敏感性中具有雙向作用。在腫瘤細胞形成早期刺激自噬能夠清除受損細胞器,分解細胞內過多的有害物質(如受損的線粒體等),可以阻止正常細胞向腫瘤細胞的轉化。然而,腫瘤細胞中晚期,刺激自噬可清除因受電離輻射、化療藥物等細胞毒性刺激后的受損線粒體和大分子物質,達到營養(yǎng)物質的再循環(huán)利用,阻斷線粒體的凋亡信號級聯(lián)傳導,使腫瘤細胞逃避凋亡。另外,在腫瘤治療中,放療或者化療聯(lián)合調節(jié)自噬表達可以協(xié)同或拮抗腫瘤細胞生長,具體表現(xiàn)在腫瘤放化療中抑制或誘導自噬可以改變腫瘤細胞的凋亡率。因此,在放療或者化療中通過抑制自噬導致腫瘤細胞無法清除受損的細胞器和大分子物質,從而促進腫瘤細胞死亡,增強腫瘤的治療效果。為了明確自噬和鼻咽癌的關系,以及調節(jié)自噬的表達后可能對鼻咽癌產生的放療增敏效果,本研究采用細胞和分子生物學手段,選取人鼻咽低分化鱗癌細胞株CNE-2細胞為對象,觀察了CNE-2細胞在經不同劑量X線照射后自噬和凋亡水平,并且檢測了CNE-2細胞受照射及照射聯(lián)合自噬誘導劑、抑制劑處理后自噬相關蛋白的表達狀態(tài)和細胞凋亡率。研究了改變人鼻咽癌細胞系CNE-2細胞的自噬活性后,CNE-2細胞對于放射治療敏感性的變化。探明自噬對照射所致CNE-2細胞凋亡的保護性作用,為提高鼻咽癌放療敏感性提供實驗依據。研究方法：1、先利用蛋白印跡(Western-blot)技術檢測CNE-2細胞經不同濃度二磷酸氯喹(Chloroquine disphosphate, CDP)和雷帕霉素(rapamycin)處理后自噬標記蛋白微管相關蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和p62蛋白的表達情況。再通過流式細胞術(Flow cytometry, FCM)技術檢測CNE-2細胞分別經抑制自噬最明顯的二磷酸氯喹(CDP)濃度、誘導自噬最顯著的雷帕霉素(rapamycin)濃度處理后細胞的凋亡率。得到一個抑制自噬和誘導自噬最顯著而不影響細胞增殖、凋亡的藥物濃度,為后續(xù)實驗奠定基礎。2、利用蛋白印跡(Western-blot)技術檢測CNE-2細胞經不同劑量(0、2、4、6、8、10Gy)6Mv-X線照射后不同時間(24h、48h)CNE-2細胞自噬的情況,確定照射是否激活CNE-2細胞自噬,觀察自噬與照射劑量和照射后時間的相關性,確定一個誘導自噬最顯著的照射劑量和照射后時間點,為下一步實驗奠定基礎。同時采用流式細胞術(FCM)檢測CNE-2細胞經不同劑量(0、2、4、6、8、10Gy)6Mv-X線照射后不同時間(24h、48h)CNE-2細胞的凋亡率,分析照射劑量及照射時間與凋亡的相關性,從而進一步分析自噬與凋亡之間的內在聯(lián)系。最后繼續(xù)利用蛋白印跡(Western-blot)技術和流式細胞術(FCM)分別檢測CNE-2細胞經單純10Gy照射、單純自噬抑制劑二磷酸氯喹(Chloroquine disphosphate, CDP)、單純自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)、照射(10Gy)聯(lián)合二磷酸氯喹(CDP)、照射(10Gy)聯(lián)合雷帕霉素(rapamycin)及空白對照組6種不同條件處理后自噬標記蛋白微管相關蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和P62蛋白的表達水平變化及細胞存活和凋亡情況。探明自噬在照射所致CNE-2細胞凋亡中的促存活作用。研究結果：1、Western-blot結果顯示CNE-2細胞經不同濃度二磷酸氯喹(CDP)、和雷帕霉素(rapamycin)處理后微管相關蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和P62蛋白均不同程度表達。CDP處理組中40μM濃度組LC3-Ⅱ和p62表達水平均明顯高于其他各濃度組(F=719.388, F=73.885,P0.01); rapamycin處理組中20nM濃度組LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯高于其他各濃度組(F=375.12,P0.01),而p62蛋白表達水平卻明顯低于其他濃度組(F=70.770, P0.01)。FCM結果示40u M濃度CDP處理組及20nM濃度rapamycin處理組間細胞凋亡率與對照組間無明顯差異(F=0.371,P=0.705)。2、 western-blot技術顯示隨著照射劑量的增加(0、2、4、6、8、10Gy)及照射后時間的延長(24h、48h), LC3-Ⅱ蛋白表達水平呈遞增趨勢(F=35.84,P0.01),P62蛋白表達水平呈遞減趨勢(F=52.47,P0.01),當10Gy照射后48h時LC3-Ⅰ全部轉化成LC3-Ⅱ, p62表達水平最低,自噬現(xiàn)象最明顯。單純CDP組、單純rapamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合CDP組及照射聯(lián)合rapamycin組LC3-Ⅱ蛋白表達水平較對照組均上調,其中照射聯(lián)合rapamycin組LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯高于其他各組(F=128.03,P0.01),而該組P62蛋白表達水平顯著低于其他5組(即單純CDP組、單純rapamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合CDP組)(F=117.52, P0.01); rapamycin組P62表達水平下調,CDP組P62表達水平無明顯變化；照射聯(lián)合CDP組P62蛋白表達水平較其他5組(即單純CDP組、單純rapamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合rapamycin組)顯著上調(F=428.70,P0.01)。流式細胞術(FCM)結果顯示隨著照射劑量的增加(0、2、4、6Gy)及照射后時間的延長(24h、48h)CNE-2細胞凋亡率呈現(xiàn)遞增趨勢,但當單次劑量達8、10Gy時凋亡率遞增趨勢趨于平坦,細胞凋亡率不再是單純的劑量遞增趨勢。后續(xù)實驗中照射聯(lián)合CDP組細胞凋亡率顯著高于其他5組(F=231.68,P0.01)；而照射聯(lián)合rapamycin組細胞凋亡率低于單純10Gy照射組(F=79.175,P0.01)。單純照射組、單純CDP處理組及單純rapamycin處理組三組間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.198; t=-3.222; t=-1.902.p均0.05)研究結論：1、二磷酸氯喹(CDP)可以抑制CNE-2細胞的自噬功能,且當在40μ M濃度時抑制功能最顯著,而不引起細胞凋亡；雷帕霉素(rapamycin)可以誘導CNE-2細胞發(fā)生自噬,且在20nM濃度時誘導自噬現(xiàn)象最明顯,而不影響細胞增殖。2、單純照射可以誘導CNE-2細胞發(fā)生自噬和凋亡,其中自噬與照射劑量和照射時間呈現(xiàn)一定量效和時效關系,單次劑量10Gy照射后48h時CNE-2細胞自噬水平最高；在單次照射劑量≤6Gy時細胞凋亡率亦呈現(xiàn)一定量效和時效關系,單次照射劑量8Gy、10Gy照射后48h凋亡率基本達一個平臺期。3、抑制自噬可以促進照射所致的人鼻咽癌低分化鱗癌CNE-2細胞凋亡。反之,誘導自噬抑制可以抑制照射所致CNE-2細胞的凋亡,故在人鼻咽癌細胞中,自噬對照射引起的細胞凋亡有一定的保護作用。抑制自噬可能會提高鼻咽癌患者放療療效。
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【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.63

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 周支瑞;電離輻射誘導人鼻咽癌細胞系CNE-2細胞自噬及自噬抑制與CNE-2細胞放射敏感性關系的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1733878