電離輻射誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞自噬及其與凋亡關(guān)系的研究
發(fā)布時(shí)間:2018-04-11 01:35
本文選題:自噬 + 細(xì)胞凋亡; 參考:《廣西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文
【摘要】:研究背景及目的:鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)的高發(fā)腫瘤,其特殊的臨床解剖部位和生物學(xué)行為,使得放療被認(rèn)為是首選的治療手段。近年來(lái),隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步和加速器設(shè)備的升級(jí),使得三維適形放射治療(3-dimensional conformal radiotherapy,3-DCRT)技術(shù)、調(diào)強(qiáng)適形放射治療(intensity modulated radiotherapy, IMRT)技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。3-DCRT技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)放射劑量分布在空間三維方向上與腫瘤形狀一致,而IMRT不僅劑量分布與腫瘤形狀一致,而且劑量強(qiáng)度分布也可以調(diào)節(jié),這使得鼻咽癌的5年生存率大大提高,尤其是早期患者的5年生存率可達(dá)80%-90%。然而,臨床上仍有部分病人尤其是中晚期患者放療后出現(xiàn)局部殘留或局部復(fù)發(fā),其中腫瘤細(xì)胞在放療過(guò)程中的放射抗拒性是重要原因之一。自噬(autophagy)是一個(gè)古老的生物學(xué)現(xiàn)象,最早來(lái)源于希臘語(yǔ),其字面意思是自我吞噬,廣泛存在于酵母和其它較低級(jí)生命體中,是生物降解胞內(nèi)蛋白、完成細(xì)胞器轉(zhuǎn)化、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式,也是哺乳動(dòng)物清除癌細(xì)胞的手段之一。近年來(lái)的研究顯示:自噬是不同于凋亡的另一種程序性細(xì)胞死亡,是長(zhǎng)壽命蛋白和細(xì)胞器的代謝主要依靠途徑之一。在人類自噬過(guò)程中比較明確的和研究較多的是Beclin1基因和其編碼蛋白。自噬體形成必需的微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAPLC3)和p62蛋白也常常用于自噬的檢測(cè)。為了維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),正常情況下細(xì)胞的自噬水平維持在一個(gè)較低的水平,當(dāng)細(xì)胞受到一些外界刺激時(shí)便可以迅速上調(diào),如:營(yíng)養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)激素缺乏、細(xì)胞結(jié)構(gòu)重建、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)過(guò)多的受損細(xì)胞器或代謝廢物等。自噬過(guò)程主要受兩種營(yíng)養(yǎng)感受器的調(diào)節(jié):即mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)途徑依賴的自噬和不依賴mTOR途徑的自噬。TOR激酶(target of rapamycin(TOR)kinase)是氨基酸、ATP和激素的感受器,對(duì)細(xì)胞的分化生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,發(fā)揮“門衛(wèi)(gate-keeper)"作用,在營(yíng)養(yǎng)充分時(shí)關(guān)閉自噬信號(hào)。而真核起始因子2激酶Gcn2(eukaryoticinitiation factor2(eIF2)kinase Gcn2)及其下游靶位Gcn4——即自噬基因的轉(zhuǎn)錄反式作用子,在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)則啟動(dòng)自噬信號(hào)。位于TOR激酶下游的主要是一些編碼自噬ATG蛋白的相關(guān)基因,參與自噬的發(fā)生、融合、成熟、再循環(huán)。雷帕霉素及其類似物是TOR受體的拮抗劑,因此能夠誘導(dǎo)自噬。另外,較常用的自噬抑制劑有氯喹(Chloroquine disphosphate)、二磷酸氯喹及3-甲基腺嘌呤(3MA)等。自噬在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和治療敏感性中具有雙向作用。在腫瘤細(xì)胞形成早期刺激自噬能夠清除受損細(xì)胞器,分解細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的有害物質(zhì)(如受損的線粒體等),可以阻止正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。然而,腫瘤細(xì)胞中晚期,刺激自噬可清除因受電離輻射、化療藥物等細(xì)胞毒性刺激后的受損線粒體和大分子物質(zhì),達(dá)到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的再循環(huán)利用,阻斷線粒體的凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo),使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡。另外,在腫瘤治療中,放療或者化療聯(lián)合調(diào)節(jié)自噬表達(dá)可以協(xié)同或拮抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),具體表現(xiàn)在腫瘤放化療中抑制或誘導(dǎo)自噬可以改變腫瘤細(xì)胞的凋亡率。因此,在放療或者化療中通過(guò)抑制自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法清除受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡,增強(qiáng)腫瘤的治療效果。為了明確自噬和鼻咽癌的關(guān)系,以及調(diào)節(jié)自噬的表達(dá)后可能對(duì)鼻咽癌產(chǎn)生的放療增敏效果,本研究采用細(xì)胞和分子生物學(xué)手段,選取人鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株CNE-2細(xì)胞為對(duì)象,觀察了CNE-2細(xì)胞在經(jīng)不同劑量X線照射后自噬和凋亡水平,并且檢測(cè)了CNE-2細(xì)胞受照射及照射聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑、抑制劑處理后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)狀態(tài)和細(xì)胞凋亡率。研究了改變?nèi)吮茄拾┘?xì)胞系CNE-2細(xì)胞的自噬活性后,CNE-2細(xì)胞對(duì)于放射治療敏感性的變化。探明自噬對(duì)照射所致CNE-2細(xì)胞凋亡的保護(hù)性作用,為提高鼻咽癌放療敏感性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1、先利用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度二磷酸氯喹(Chloroquine disphosphate, CDP)和雷帕霉素(rapamycin)處理后自噬標(biāo)記蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和p62蛋白的表達(dá)情況。再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)技術(shù)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞分別經(jīng)抑制自噬最明顯的二磷酸氯喹(CDP)濃度、誘導(dǎo)自噬最顯著的雷帕霉素(rapamycin)濃度處理后細(xì)胞的凋亡率。得到一個(gè)抑制自噬和誘導(dǎo)自噬最顯著而不影響細(xì)胞增殖、凋亡的藥物濃度,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2、利用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同劑量(0、2、4、6、8、10Gy)6Mv-X線照射后不同時(shí)間(24h、48h)CNE-2細(xì)胞自噬的情況,確定照射是否激活CNE-2細(xì)胞自噬,觀察自噬與照射劑量和照射后時(shí)間的相關(guān)性,確定一個(gè)誘導(dǎo)自噬最顯著的照射劑量和照射后時(shí)間點(diǎn),為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同劑量(0、2、4、6、8、10Gy)6Mv-X線照射后不同時(shí)間(24h、48h)CNE-2細(xì)胞的凋亡率,分析照射劑量及照射時(shí)間與凋亡的相關(guān)性,從而進(jìn)一步分析自噬與凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系。最后繼續(xù)利用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測(cè)CNE-2細(xì)胞經(jīng)單純10Gy照射、單純自噬抑制劑二磷酸氯喹(Chloroquine disphosphate, CDP)、單純自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)、照射(10Gy)聯(lián)合二磷酸氯喹(CDP)、照射(10Gy)聯(lián)合雷帕霉素(rapamycin)及空白對(duì)照組6種不同條件處理后自噬標(biāo)記蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和P62蛋白的表達(dá)水平變化及細(xì)胞存活和凋亡情況。探明自噬在照射所致CNE-2細(xì)胞凋亡中的促存活作用。研究結(jié)果:1、Western-blot結(jié)果顯示CNE-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度二磷酸氯喹(CDP)、和雷帕霉素(rapamycin)處理后微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)和P62蛋白均不同程度表達(dá)。CDP處理組中40μM濃度組LC3-Ⅱ和p62表達(dá)水平均明顯高于其他各濃度組(F=719.388, F=73.885,P0.01); rapamycin處理組中20nM濃度組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各濃度組(F=375.12,P0.01),而p62蛋白表達(dá)水平卻明顯低于其他濃度組(F=70.770, P0.01)。FCM結(jié)果示40u M濃度CDP處理組及20nM濃度rapamycin處理組間細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組間無(wú)明顯差異(F=0.371,P=0.705)。2、 western-blot技術(shù)顯示隨著照射劑量的增加(0、2、4、6、8、10Gy)及照射后時(shí)間的延長(zhǎng)(24h、48h), LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)(F=35.84,P0.01),P62蛋白表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)(F=52.47,P0.01),當(dāng)10Gy照射后48h時(shí)LC3-Ⅰ全部轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅱ, p62表達(dá)水平最低,自噬現(xiàn)象最明顯。單純CDP組、單純r(jià)apamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合CDP組及照射聯(lián)合rapamycin組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均上調(diào),其中照射聯(lián)合rapamycin組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各組(F=128.03,P0.01),而該組P62蛋白表達(dá)水平顯著低于其他5組(即單純CDP組、單純r(jià)apamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合CDP組)(F=117.52, P0.01); rapamycin組P62表達(dá)水平下調(diào),CDP組P62表達(dá)水平無(wú)明顯變化;照射聯(lián)合CDP組P62蛋白表達(dá)水平較其他5組(即單純CDP組、單純r(jià)apamycin組、單純10Gy照射組、照射聯(lián)合rapamycin組)顯著上調(diào)(F=428.70,P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加(0、2、4、6Gy)及照射后時(shí)間的延長(zhǎng)(24h、48h)CNE-2細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),但當(dāng)單次劑量達(dá)8、10Gy時(shí)凋亡率遞增趨勢(shì)趨于平坦,細(xì)胞凋亡率不再是單純的劑量遞增趨勢(shì)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中照射聯(lián)合CDP組細(xì)胞凋亡率顯著高于其他5組(F=231.68,P0.01);而照射聯(lián)合rapamycin組細(xì)胞凋亡率低于單純10Gy照射組(F=79.175,P0.01)。單純照射組、單純CDP處理組及單純r(jià)apamycin處理組三組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.198; t=-3.222; t=-1.902.p均0.05)研究結(jié)論:1、二磷酸氯喹(CDP)可以抑制CNE-2細(xì)胞的自噬功能,且當(dāng)在40μ M濃度時(shí)抑制功能最顯著,而不引起細(xì)胞凋亡;雷帕霉素(rapamycin)可以誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞發(fā)生自噬,且在20nM濃度時(shí)誘導(dǎo)自噬現(xiàn)象最明顯,而不影響細(xì)胞增殖。2、單純照射可以誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡,其中自噬與照射劑量和照射時(shí)間呈現(xiàn)一定量效和時(shí)效關(guān)系,單次劑量10Gy照射后48h時(shí)CNE-2細(xì)胞自噬水平最高;在單次照射劑量≤6Gy時(shí)細(xì)胞凋亡率亦呈現(xiàn)一定量效和時(shí)效關(guān)系,單次照射劑量8Gy、10Gy照射后48h凋亡率基本達(dá)一個(gè)平臺(tái)期。3、抑制自噬可以促進(jìn)照射所致的人鼻咽癌低分化鱗癌CNE-2細(xì)胞凋亡。反之,誘導(dǎo)自噬抑制可以抑制照射所致CNE-2細(xì)胞的凋亡,故在人鼻咽癌細(xì)胞中,自噬對(duì)照射引起的細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用。抑制自噬可能會(huì)提高鼻咽癌患者放療療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2012
【分類號(hào)】:R739.63
【引證文獻(xiàn)】
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1 周支瑞;電離輻射誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞自噬及自噬抑制與CNE-2細(xì)胞放射敏感性關(guān)系的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年
,本文編號(hào):1733878
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