本文選題：角膜移植　切入點：致耐受樹突細胞　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景目前全球范圍內(nèi)致盲性眼病的主要病因之一依然是角膜盲,角膜移植是角膜病致盲患者治療不可逆角膜盲最主要、最有效的復明手段。近年來組織器官移植在臨床上取得了巨大的進步,普遍應用于各個器官功能衰竭的治療。由于眼表組織特有的解剖學、免疫學以及機械屏障的特性,相對其他組織器官缺乏血管以及淋巴管,在沒有高危因素的角膜移植病例中,術后兩年移植物存活良好的概率高達90%。但是角膜并不是絕對意義上的免疫赦免組織,角膜移植術后難以避免的免疫排斥反應仍然是阻礙手術成功的主要原因之一。在高危角膜移植的病例中術后免疫排斥反應尤為嚴重,在全身應用或局部應用免疫抑制藥物的情況下,由于移植手術受體植床大量新生血管生成和長期的炎癥反應,術后免疫排斥造成手術成功率下降明顯。所以防治角膜移植術后的免疫排斥反應,提升角膜移植物的術后存活率以及改善預后的研究依然是近年來的熱點問題。近年來,臨床防治角膜移植術后免疫排斥反應的最主要手段包括皮質(zhì)類固醇激素和環(huán)孢霉素A等藥物的局部或全身應用,雖然上述方法在臨床研究中取得了一些較為滿意的結(jié)果。但是這些免疫抑制藥物的作用與其臨床的用藥劑量和用藥時間呈明顯的正相關,還因為其非特異性抑制患者免疫系統(tǒng)應答的特點,臨床應用過程中將嚴重破壞患者的免疫系統(tǒng)機制,并因為其產(chǎn)生的多種術后并發(fā)癥反而加劇了免疫排斥反應的發(fā)生,導致角膜移植手術的最終失敗。樹突細胞是機體細胞中能高效攝取、加工處理并遞呈抗原的一類細胞,它還可以在誘導未致敏初始T細胞增殖的同時激活T細胞免疫應答促進依賴性抗體產(chǎn)生。樹突細胞具有顯著的分化異質(zhì)性,在分化成熟過程中經(jīng)歷的各種前體細胞、未成熟細胞和成熟細胞不僅在細胞表型上差異明顯,其在機體免疫應答過程中的作用也各不相同。當前體細胞分化為未成熟樹突細胞時,分布于機體外周組織器官間質(zhì)中,這時的樹突細胞具有較強的抗原吞噬能力并處理外源性抗原,并結(jié)合到內(nèi)源性組織相容性復合體分子上。未成熟樹突細胞在機體內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定時處于靜息狀態(tài),此時的遷移屬于非抗原依賴性,而當機體受到外源性刺激時未成熟樹突細胞按照抗原依賴性的方式遷移,并且在遷移過程中受部分刺激因素影響而逐漸向成熟樹突細胞分化,在這個過程中活化并參與啟動機體的免疫應答機制。研究中把既能呈現(xiàn)未成熟樹突細胞表型又能夠誘導T細胞免疫耐受的樹突細胞稱為致耐受樹突細胞。通過體外誘導骨髓源性樹突細胞分化為致耐受樹突細胞介導機體免疫耐受,從而治療角膜移植術后免疫排斥是一種切實可行的實驗研究方案。然而獲得穩(wěn)定的致耐受樹突細胞是促進免疫耐受并延長移植物存活的關鍵。目前實驗研究中誘導分化獲得未成熟樹突細胞的方法主要是通過粒細胞巨噬細胞集落刺激因子共培養(yǎng)或雷帕霉素、環(huán)孢霉素、糖皮質(zhì)激素等藥物在體內(nèi)體外抑制樹突細胞分化。上述方法在實驗研究中取得了一些較為滿意的結(jié)果,但獲得的樹突細胞是否具有長期維持未成熟樹突細胞的表型和實現(xiàn)致耐受樹突細胞功能的特點還有待商榷。NF-κB是機體細胞在凋亡、增殖、分化以及免疫應答過程中的關鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。有超過150種的基因通過NF-κB介導參與多種因子的調(diào)控表達,其中包括Toll樣受體、趨化因子受體、急性期反應蛋白、生長因子、抗凋亡蛋白、細胞因子受體以及細胞粘附分子等。NF-κB對樹突細胞的分化成熟具有重要作用。未成熟樹突細胞在機體內(nèi)受到抗原刺激后引起抗原依賴性遷移并且在遷移過程中逐漸向成熟樹突細胞分化。而NF-κB可以參與啟動MHC、CD80和CD86的基因轉(zhuǎn)錄。樹突細胞在成熟過程中的MHC、CD80、CD86和細胞間粘附分子和共刺顯著高表達,同時刺激未致敏的初始T細胞進行免疫應答。T細胞的刺激活化需要雙重或者多重信號的誘導,這些信號就包括上面提到的CD80、CD86、MHC等信號以及相應的抗原多肽。NF-κB蛋白是由Rel和NF-κB兩個家族成員共同構成的,一個是前體家族包括NF-κB1和NF-κB2;另一個是Rel家族包括c-Rel、v-Rel、Rel-B和Rel-A (p65)。Rel/NF-κB家族的Rel同源結(jié)構域包括末端結(jié)構域、DNA結(jié)合結(jié)構域、二聚體結(jié)構域和核定位序列結(jié)構域。除了成員間具有相同的同源結(jié)構域外,Rel-A, Rel-B和c-Rel分子還具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域,在功能上兩個結(jié)構域也有所區(qū)別,轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域主要負責NF-κB二聚體的激活與轉(zhuǎn)錄。核定位序列結(jié)構域可以介導Rel-A進入細胞核內(nèi)并通過Rel-A、Rel-B和c-Rel所特有的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域介導Rel-A的基因轉(zhuǎn)錄。Rel-A的磷酸化和乙�；怯绊慛F-κB活化并啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關鍵,目前對NF-κB活性調(diào)控的研究重點主要集中在對Rel-A的蛋白修飾。當絲氨酸276受到激酶刺激后,改變了非磷酸化狀態(tài)下Rel-A的分子結(jié)構,增強Rel-A與環(huán)腺苷酸應答元件結(jié)合蛋白的結(jié)合,從而提高NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。因此我們推測通過干擾Rel-A基因表達,影響Rel-A的磷酸化程度,進而減弱NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性來獲得致耐受樹突細胞。RNA干擾技術是通過細胞導入外源性和內(nèi)源性dsRNA在生物體內(nèi)誘導同源靶基因的mRNA序列特異性降解,從而引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象。由于RNA誘導沉默復合物可以二次利用并經(jīng)過RNA聚合酶的催化,因此在整個過程中可以催化以并放大RNA的效果。siRNA導入技術的發(fā)展為RNA干擾技術的應用提供了更多的選擇,各種病毒介導的siRNA表達是最為有效的一類載體。慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎發(fā)展起來的基因治療載體,雖然屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的范疇。它有著更廣泛的宿主對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力,載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,有效對抗轉(zhuǎn)錄沉默作用從而達到持久性表達,載體中可以插入特異性的啟動子和增強子,提高轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄靶向性,使慢病毒載體中的目的基因在特定的組織細胞中表達。本課題在前期研究和最新進展的基礎上,構建大鼠角膜移植免疫排斥模型,通過粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和IL-4共培養(yǎng)誘導分化大鼠骨髓源性樹突細胞,采用RNA干擾技術,篩選出高效抑制Rel-A表達的siRNA序列,構建針對Rel-A的siRNA慢病毒載體細胞,將慢病毒載體轉(zhuǎn)染至骨髓源性樹突細胞,降低NF-κB表達及活性,以求獲得穩(wěn)定致耐受樹突細胞的新方法,同時將該致耐受樹突細胞注入大鼠角膜移植模型,探尋Rel-A低表達的致耐受樹突細胞誘導大鼠角膜移植免疫耐受的作用及機制,為臨床角膜移植誘導免疫耐受治療免疫排斥反應提供理論和實驗依據(jù)。第一部分大鼠骨髓源性樹突細胞的體外誘導分化及生物學性能檢測研究目的結(jié)合最新研究進展,進一步探討體外誘導分化具有未成熟樹突細胞表型和致耐受特性的樹突細胞的方法。研究方法本部分實驗根據(jù)不同培養(yǎng)周期誘導大鼠骨髓源性前體細胞分化為未成熟樹突細胞。通過顯微鏡觀察不同培養(yǎng)時間中樹突細胞的生長及形態(tài)特征；通過流式細胞儀檢測誘導分化后樹突細胞的表面標志物CD80、CD86和MHC-Ⅱ的陽性表達率；通過混合淋巴細胞反應實驗驗證不同培養(yǎng)時間誘導分化的未成熟樹突細胞是否具有致耐受樹突細胞的生物學特性；并使用酶聯(lián)免疫吸附實驗鑒定樹突細胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ表達水平。結(jié)果培養(yǎng)至第六天和第八天的樹突細胞在CD80、CD86和MHC-Ⅱ的陽性表達率方面明顯低于(p0.05)培養(yǎng)至第十天的樹突細胞；培養(yǎng)至第六天和第八天的樹突細胞在混合細胞反應中的吸光值明顯低于(p0.05)培養(yǎng)至第十天的樹突細胞；樹突細胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ表達水平在三組間逐漸升高。結(jié)論持續(xù)培養(yǎng)至第六天時收獲的樹突細胞具有未成熟樹突細胞的表型并且具有致耐受樹突細胞的生物學特性。體外誘導大鼠骨髓性樹突細胞分化為致耐受樹突細胞過程中對培養(yǎng)時間和誘導分化培養(yǎng)液的精確調(diào)整極為敏感,樹突細胞表面標志物的特異性表達不能作為鑒定致耐受樹突細胞的唯一標準。第二部分構建p65低表達慢病毒載體和慢病毒轉(zhuǎn)染對樹突細胞生物學性能及細胞因子影響研究目的設計針對p65低表達的siRNA序列,建立慢病毒載體系統(tǒng)并驗證其對靶基因的沉默效果,將慢病毒轉(zhuǎn)染至誘導分化后的致耐受樹突細胞,進一步探討針對p65低表達的慢病毒對于樹突細胞生物學性能的影響。研究方法根據(jù)siRNA設計原則與方法,設計三條針對大鼠p65基因的特異性干擾序列和一條陰性對照序列；體外轉(zhuǎn)染293T細胞后,通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應實驗和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測細胞中p65的蛋白表達和mRNA表達水平；通過流式細胞儀檢測在慢病毒轉(zhuǎn)染或/和脂多糖刺激后對樹突細胞表型的影響；通過混合淋巴細胞反應實驗驗證在慢病毒轉(zhuǎn)染或/和脂多糖刺激后對樹突細胞致耐受生物學特性的影響；通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測在慢病毒轉(zhuǎn)染或/和脂多糖刺激后樹突細胞培養(yǎng)上清中IL-10、IL-17和IFN-γ的蛋白表達與mRNA表達水平；通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗和熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cp65對IL-10、IL-17和IFN-γ的直接影響作用。結(jié)果設計合成針對p65低表達的siRNA序列可以有效抑制細胞中p65和NF-κB的蛋白表達水平并顯著降低p65的mRNA表達水平(p0.05)；蛋白質(zhì)免疫印記實驗結(jié)果中對照組的p65和NF-κB條帶明顯強于慢病毒組；混合淋巴細胞反應實驗中脂多糖刺激組(LPS)相比其他三組對大鼠同種異體T細胞的增殖具有明顯刺激作用(p0.05)；流式細胞術的分析結(jié)果中脂多糖刺激組(LPS)在CD80、CD86和CD11c+MHC-Ⅱ的檢測中均明顯高于(p0.05)對照組(Control)、慢病毒組(Lv)和慢病毒轉(zhuǎn)染后脂多糖刺激組(Lv+LPS);細胞上清的p65、IL-17和IFN-γ蛋白表達和mRNA檢測結(jié)果中脂多糖刺激組(LPS)明顯高于(p0.005)其他三組；細胞上清的IL-10蛋白表達蛋白表達和mRNA檢測結(jié)果中對照組(Control)明顯高于(p0.005)脂多糖刺激組(LPS)、慢病毒組(Lv)和慢病毒轉(zhuǎn)染后脂多糖刺激組(Lv+LPS),脂多糖刺激組(LPS)明顯高于(p0.005)慢病毒組(Lv)和慢病毒轉(zhuǎn)染后脂多糖刺激組(Lv+LPS);熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果中IFN-γ、IL-17和IL-10的慢病毒組RLU指數(shù)都明顯低于對照組；染色質(zhì)免疫共沉淀實驗結(jié)果中慢病毒組的IFN-γ、IL-17和IL-10條帶相對input組和慢病毒空白對照組都明顯減弱。結(jié)論建立的針對p65低表達的慢病毒載體可以有效減少p65和NF-κB的蛋白表達水平并顯著降低p65的mRNA表達水平。無論是否進行脂多糖刺激,慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓源性樹突細胞都可以保持未成熟樹突細胞的表型和致耐受樹突細胞的生物學特征。慢病毒轉(zhuǎn)染后的骨髓源性樹突細胞可以減少IL-17和IFN-γ的蛋白表達和mRNA表達水平。p65可以直接結(jié)合到IL-10、IL-17和IFN-y的啟動子區(qū)域上,并啟動IL-10、IL-17和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄翻譯表達,且引物序列具有特異性。第三部分p65低表達的致耐受樹突細胞在角膜移植術后免疫排斥過程中的效果及機制研究目的探討針對p65低表達的慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓源性樹突細胞對于同種異體大鼠正位穿透性角膜移植術后免疫排斥反應的影響和作用機制。研究方法建立同種異體大鼠正位穿透性角膜移植模型,受體與供體大鼠分別隨機分為四個實驗組,分別于術前、術后注射骨髓源性樹突細胞、慢病毒轉(zhuǎn)染后樹突細胞,術后觀察移植植片的存活時間、角膜新生血管和角膜不透明度并建立評估體系；通過免疫組化染色分析角膜植片的病理變化和相關細胞因子的表達情況；通過流式細胞儀分析大鼠角膜移植術后脾臟中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和CD4+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的表達率；通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測大鼠血清中IL-10、IL-17和IFN-y的蛋白表達與mRNA表達水平。結(jié)果對照組中大鼠移植植片的平均存活時間為20±6.55天明顯長于BMDC組的平均存活時間(13.47±2.56天),Lv-p65-DC組和Lv-p65-DC-cont組的大鼠移植植片的平均存活時間都超過30天；BMDC組的不透明度從術后的第12天開始明顯高于其他三組(p0.05),在術后第三周,Lv-p65-DC組分別低于或高于對照組和Lv-p65-DC-cont組；術后第10天,Lv-p65-DC-cont組的新生血管評分顯著低于其余三組；免疫組化實驗結(jié)果表明IL-17的表達具有特異性,并明顯富集于角膜新生血管壁周圍；BMDC組和對照組的調(diào)節(jié)性T細胞表達率明顯高于其他兩組；術后第三周,Lv-p65-DC組的p65 mRNA和蛋白表達水平明顯高于Lv-p65-DC-cont組；在術后第一周,對照組的IL-10 mRNA和蛋白表達水平明顯高于其他三組,術后第三周開始,對照組和Lv-p65-DC組的IL-10mRNA和蛋白表達水平明顯高于Lv-p65-DC-cont組；IL-17和IFN-y的mRNA和蛋白表達特征較為近似,術后第一周,Lv-p65-DC組和Lv-p65-DC-cont組的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于BMDC組和對照組；術后第三周開始,對照組和Lv-p65-DC組的mRNA和蛋白表達水平都明顯高于Lv-p65-DC-cont組。結(jié)論未經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的骨髓源性樹突細胞在進入受體大鼠體內(nèi)后受到炎癥信號影響逐漸向成熟樹突細胞分化,增強了術后的免疫排斥反應。大鼠角膜移植術前注射慢病毒轉(zhuǎn)染的樹突細胞可以誘導調(diào)節(jié)性T細胞活化,延長植片的存活時間并減輕移植術后角膜新生血管的生成和降低植片的不透明度。針對p65低表達的慢病毒可以降低術后IL-10、IL-17和IFN-γ的表達水平,同時慢病毒轉(zhuǎn)染后樹突細胞注射誘導大鼠角膜移植免疫耐受的治療方式具有時間依賴性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R779.65

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本文編號：1721001