本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：光感受器細(xì)胞損傷　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：光感受器細(xì)胞損傷可發(fā)生于視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜光損傷、眼外傷等疾病中,其不可逆性損傷可導(dǎo)致視功能的嚴(yán)重受損,甚至導(dǎo)致盲的發(fā)生。其中視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment,RD)是最常見的嚴(yán)重威脅視力的疾病之一,發(fā)生于視網(wǎng)膜全層裂孔、玻璃體視網(wǎng)膜牽拉或者視網(wǎng)膜下滲出等情況而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮的分離,從而導(dǎo)致光感受器細(xì)胞失去代謝和營養(yǎng)支持而發(fā)生損傷。由于視網(wǎng)膜脫離過程中涉及到的光感受器細(xì)胞死亡受到多種信號途徑相互作用影響,同時(shí)伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生、視網(wǎng)膜三級神經(jīng)元激活及重塑等過程,因此單一針對某條通路展開治療不能達(dá)到完全控制細(xì)胞凋亡并保持視網(wǎng)膜完整性的目的。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在眼科多種疾病治療中已開展了廣泛的研究,如角膜緣干細(xì)胞缺乏、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、缺血及視神經(jīng)損傷等,已被證實(shí)具有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的潛能,同時(shí)能夠表達(dá)多種細(xì)胞因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子,同時(shí)抑制局部炎癥反應(yīng)改善視網(wǎng)膜微環(huán)境,減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡;修復(fù)RPE細(xì)胞,保護(hù)視網(wǎng)膜外屏障,并可能活化視網(wǎng)膜干細(xì)胞。因此,本研究擬探討B(tài)MSCs在視網(wǎng)膜脫離動(dòng)物模型體內(nèi)及低氧培養(yǎng)的視錐細(xì)胞系661w細(xì)胞中所發(fā)揮的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法1.體外實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MSCs對661w細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制(1)利用低氧培養(yǎng)法制備細(xì)胞損傷模型,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,MTT法檢測低氧不同時(shí)長后細(xì)胞活力改變,同時(shí)利用Annexin V-PI法、線粒體膜電位檢測及caspase-3表達(dá)等方法檢測細(xì)胞凋亡情況,利用Western blot、酸性囊泡標(biāo)記物觀察低氧后細(xì)胞自噬情況;同時(shí)低氧處理前1h加入自噬抑制劑3-MA,觀察細(xì)胞活力、凋亡及自噬的變化;(2)利用transwell培養(yǎng)體系將損傷的661w細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng),同樣方法檢測細(xì)胞活力、凋亡情況及自噬情況改變。2.體內(nèi)研究分析BMSCs視網(wǎng)膜保護(hù)作用及機(jī)制(1)分離獲得BMSCs原代培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定;(2)制備視網(wǎng)膜脫離大鼠模型,將培養(yǎng)的BMSCs移植入視網(wǎng)膜下,觀察移植后視網(wǎng)膜復(fù)位時(shí)間段內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜及BMSCs情況;以造模后未進(jìn)行處理組及視網(wǎng)膜下注射PBS組為對照進(jìn)行比較;(3)初步檢測BMSCs對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用效果:組織切片及HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)及外核層厚度,免疫熒光法及Western blot法檢測視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞標(biāo)記物Rhodopsin表達(dá)情況;(4)研究BMSCs對視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制:利用TUNEL法計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)Western blot檢測凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況;Western blot法檢測視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量;(5)BMSCs在眼內(nèi)情況:利用細(xì)胞標(biāo)記試劑盒標(biāo)記BMSCs后移植到RD模型視網(wǎng)膜下,免疫熒光法檢測移植后的BMSCs在眼內(nèi)移行及分化情況。結(jié)果1.661w細(xì)胞低氧培養(yǎng)2h、4h、8h、16h、24h及48h后,細(xì)胞活力發(fā)生不同程度的降低,伴有細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡數(shù)量增加及細(xì)胞形態(tài)異常,同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬在低氧后開始增加,低氧8h時(shí)達(dá)到高峰后降低,利用3-MA抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞活力下降;2.與BMSCs共培養(yǎng)的661w細(xì)胞形態(tài)較為正常,且活力有所增加,凋亡細(xì)胞明顯減少,而共培養(yǎng)時(shí)加入自噬抑制劑,即使與BMSCs共培養(yǎng),細(xì)胞活力仍發(fā)生降低的同時(shí)凋亡細(xì)胞增多;3.移植BMSCs的視網(wǎng)膜脫離眼中,視網(wǎng)膜外核層厚度更接近正常視網(wǎng)膜,與空白組及對照相相比光感受器細(xì)胞較厚及排列較為規(guī)整;4.移植BMSCs后,早期視網(wǎng)膜外核層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而且Caspase-3,8,9的表達(dá)量均較對照減少;5.移植BMSCs后的短期內(nèi),視網(wǎng)膜LC-3II表達(dá)升高、P62表達(dá)降低,視網(wǎng)膜內(nèi)自噬激活;6.移植干細(xì)胞眼內(nèi)沒有觀察到視網(wǎng)膜下移植的BMSCs有明顯的移行整合過程及向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的傾向。結(jié)論本研究以BMSCs為研究對象,選擇視網(wǎng)膜脫離及細(xì)胞低氧培養(yǎng)作為體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探索干細(xì)胞在其中發(fā)揮的保護(hù)作用及可能的部分機(jī)制。結(jié)果提示低氧環(huán)境對體外培養(yǎng)的光感受器細(xì)胞系661w細(xì)胞造成損傷,而早期自噬水平的提高有利于幫助細(xì)胞度過低氧應(yīng)激,降低細(xì)胞凋亡,保護(hù)細(xì)胞活力;與BMSCs共培養(yǎng)能夠降低低氧對661w的損傷,減少細(xì)胞凋亡,這種保護(hù)作用的發(fā)揮在一定程度上是由BMSCs介導(dǎo)的自噬調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。視網(wǎng)膜脫離后視網(wǎng)膜細(xì)胞特別是光感受器細(xì)胞發(fā)生了包括凋亡、自噬、壞死、增殖等一系列病理變化,致使視網(wǎng)膜復(fù)位后仍存在光感受器細(xì)胞形態(tài)功能不能完全恢復(fù);BMSCs眼內(nèi)移植后能夠明顯減少光感受器細(xì)胞死亡,保存視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu),其能夠減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡,并在移植后短期內(nèi)激活視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬,幫助視網(wǎng)膜細(xì)胞度過視網(wǎng)膜脫離后的缺氧及低營養(yǎng)狀態(tài)期。本實(shí)驗(yàn)觀察BMSCs在光感受器細(xì)胞損傷時(shí)發(fā)揮的保護(hù)作用的同時(shí)研究其發(fā)揮作用的機(jī)制,一方面可以通過抑制細(xì)胞凋亡來減少細(xì)胞損失,另一方面可以激活細(xì)胞自噬從使細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)中存活。
[Abstract]:Objective To investigate the protective effect and mechanism of retinal detachment ( RD ) on retinal detachment , retinal pigment degeneration , age - related macular degeneration , ischemia and optic nerve injury . The results showed that the number of apoptotic cells in the retina was decreased and the number of apoptotic cells was decreased after the transplantation into the retina .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1
，

本文編號：1674404