發(fā)布時間：2018-03-28 03:20

  本文選題：自噬　切入點：年齡相關性白內(nèi)障　出處：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：年齡相關性白內(nèi)障是一種中老年疾病,嚴重危害老年人視力的常見眼科疾病。氧化應激是白內(nèi)障發(fā)病的主要因素之一。紫外線輻射、外源性氧化物質(zhì)等均可以使晶狀體上皮細胞(HLEs)產(chǎn)生活性氧片段(Reactive oxygen species, ROS),進一步使組織和細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化以及DNA的損害,從而形成白內(nèi)障。自噬是真核細胞的一種具有自我保護功能的生理現(xiàn)象,主要幫助細胞適應各種不良刺激,是細胞維持內(nèi)環(huán)境的自穩(wěn)并且實現(xiàn)自我更新的基本途徑。上調(diào)自噬可通過激活磷酸化AKT通路,從而對HLEs的遷移和增殖具有明顯的促進作用,下調(diào)自噬并抑制其功能。查閱相關文獻,我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬水平對于HLEs的功能影響,特別在H2O2誘導的氧化應激中的作用未見相關報道。因此,本研究以HLEs-B3細胞株和人HLEs-B3自噬缺陷細胞株為實驗對象,旨在探索自噬在人晶狀體上皮細胞氧化應激中的保護作用及機理,為年齡相關性白內(nèi)障的治療提供一種新的治療思路。本研究共分為三個部分,主要研究方法及結果如下。第一部分自噬水平與年齡相關性白內(nèi)障程度的相關性。目的：研究自噬水平與年齡相關性白內(nèi)障程度的相關性。方法：通過免疫熒光標記檢測年齡相關性白內(nèi)障病例的晶狀體前囊膜上皮組織標本的自噬水平,分析其與白內(nèi)障程度的相關性。步驟如下： (1)對右眼白內(nèi)障手術病例,根據(jù)裂隙燈評判晶狀體核性混濁的程度,將NC4級和NC1級白內(nèi)障病例納入統(tǒng)計； (2)收集NC4級和NC1級的晶狀體上皮組織標本并固定；(3)對晶狀體上皮組織標本進行LC3的免疫熒光標記并檢測； (4)分析LC3熒光強度與白內(nèi)障程度的相關性。結果：LC3熒光強度在NC4級白內(nèi)障中較NC1級明顯增強。結論：自噬水平與年齡相關性白內(nèi)障程度呈一定的相關性。第二部分自噬在晶狀體上皮細胞氧化應激中的作用。目的：比較HLEs-B3自噬缺陷細胞株和HLEs-B3細胞株,在外源性H202環(huán)境中細胞活力、氧化及抗氧化能力的差異。方法：通過HLEs-B3細胞轉(zhuǎn)染PEP-KO和ATG7-’-質(zhì)粒,構建PEP和A7細胞。然后將細胞分為六組,B3實驗組和B3對照組；PEP實驗組和PEP對照組;A7實驗組和A7對照組。首先對比不同濃度的過氧化氫(H202)刺激對B3細胞株增殖活力的影響,確定合適的H202作用濃度；之后建立外源性H202相關的氧化應激模型,對B3、PEP、A7三種細胞進行細胞增殖、死亡、氧化及抗氧化能力等指標的檢測：(1)通過CCK-8法檢測H202對細胞增殖活力的影響；(2)通過流式細胞術Annexin V/7-AAD染色檢測H202對細胞凋亡的影響； (3)通過2’7’-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢測各組細胞內(nèi)ROS熒光強度的變化; (4)運用酶生化法檢測細胞內(nèi)GSH、MDA的差異。結果：(1)CCK-8法顯示300μM H2O2抑制細胞增殖活力,但A7組較其他組增殖增加; (2)Annexin V/7-AAD染色顯示,300μM H2O2增加細胞死亡,但A7組較其他組,細胞死亡減少；(3)流式細胞儀檢測顯示,ROS熒光強度在A7組增加更明顯； (4)酶生化法顯示,H202刺激引起A7組GSH值下降更明顯；而MDA值增加更明顯。結論：在氧化應激環(huán)境下,如敲除自噬相關蛋白7,將降低細胞抗氧化能力,卻能減少細胞死亡。第三部分自噬在晶狀體上皮細胞氧化應激中的機制研究。目的：探討自噬調(diào)控H202誘導的氧化應激的分子機制。方法：B3細胞株和HLEs-B3自噬缺陷細胞株在H202處理20 h后,采用Western blot檢測各組Caspase-3、Caspase-8、 Caspase-9、Bcl-2、Bax的表達水平。結果：Western blot結果顯示,H202刺激引起A7組Caspase-3、Caspase-9、Bax增加更明顯,Bcl-2下降更明顯,而Caspase-8無明顯改變。結論：在氧化應激環(huán)境下,自噬與細胞凋亡呈相互抑制狀態(tài)；自噬性細胞死亡可能在細胞死亡中占主要作用。
[Abstract]:Age related cataract is a common eye disease in senile diseases, serious harm to the elderly eyesight. Oxidative stress is one of the main factors of cataract. Ultraviolet radiation, exogenous substances can make the oxidation of lens epithelial cells (HLEs) to produce reactive oxygen species (Reactive oxygen segment species, ROS), and further make the organization cell lipid peroxidation and DNA damage, resulting in the formation of cataract. Autophagy is a physiological phenomenon in eukaryotic cells has the function of self-protection, to adapt to a variety of adverse stimulus help cells, is a basic way to maintain the internal environment of the cell homeostasis and achieve self-renewal. Autophagy can be activated by phosphorylation of AKT pathway. It has obvious effect on HLEs proliferation and migration, down-regulation of autophagy and inhibit its function. Access to relevant literature, we found that the regulation of autophagy in HL Effect of the function of Es, especially in the oxidative stress induced H2O2 has not been reported. Therefore, in this study, HLEs-B3 cells and HLEs-B3 cells autophagy defects as the experimental object, aims to explore the protective effect and autophagy in oxidative stress in human lens epithelial cells, which provides a new idea for the treatment of the treatment of age-related cataract. This study is divided into three parts, the main research methods and results are as follows. The first part of the correlation of autophagy and age-related cataract degree. Objective: To study the relationship between autophagy and the degree of age-related cataract. Methods: the level of autophagy in immunofluorescence detection of age-related cataract lens epithelial capsule tissue specimens, and analyze its correlation with the degree of cataract. The steps are as follows: (1) cases of right eye cataract surgery, according to the Evaluation of slit lamp lens nuclear opacity level, NC4 level and NC1 level of cataract cases included in the statistics; (2) collection of NC4 grade and NC1 grade of lens epithelial tissue specimens and fixed; (3) LC3 immunofluorescence labeling and detection of lens epithelial tissue; (4) the correlation analysis of the fluorescence intensity of LC3 with the degree of cataract. Results: the fluorescence intensity of LC3 was significantly enhanced than grade NC1 in NC4 cataract. Conclusion: the correlation between autophagy and age-related cataract. The second part of autophagy in lens epithelial cells in oxidative stress by autophagy defects. Objective: To compare HLEs-B3 and HLEs-B3 cell lines, cell viability in the exogenous H202 environment, the difference between oxidation and antioxidant ability. Methods: the HLEs-B3 cells transfected with PEP-KO and ATG7- '- plasmid construction of PEP and A7 cells. Then the cells were divided into six groups, B3 Experimental group and B3 control group; PEP group and PEP control group; A7 group and A7 control group. Firstly, comparison of different concentrations of hydrogen peroxide (H202) stimulation effect on B3 cell proliferation activity, determine the appropriate concentration of H202; after the establishment of the oxidative stress model, the effect of exogenous H202 on B3 and PEP A7, three kinds of cell death detection, cell proliferation, oxidative and antioxidative indexes such as: (1) detected by H202 CCK-8 method on cell proliferation activity; (2) by flow cytometry Annexin V/7-AAD staining was used to detect the effect of H202 on cell apoptosis; (3) the 2 '7' - two acetyl chloride sodium acetate (DCFH-DA) fluorescence probe to detect the intracellular ROS fluorescence intensity; (4) using enzyme biochemical method to detect GSH, MDA difference. Results: (1) 300 M CCK-8 assay showed that H2O2 inhibited cell proliferation activity, but increase the proliferation of A7 group than in the other group Plus; (2) Annexin V/7-AAD staining showed that 300 M H2O2 increased cell death, but the A7 group compared with other groups, to reduce cell death; (3) flow cytometry showed that the fluorescence intensity of ROS increased more significantly in the A7 group; (4) showed the enzyme biochemical method, by A7 group GSH decreased more obviously stimulated H202; while the MDA value increased more significantly. Conclusion: under oxidative stress, such as knockdown of autophagy related protein 7, will reduce the antioxidant ability of cells, but it can reduce cell death mechanism. The third part is the research of autophagy in oxidative stress in lens epithelial cells. Objective: to explore the molecular mechanism for oxidative stress and autophagy regulation H202 induced. Methods: B3 cell line and HLEs-B3 cell line H202 in autophagy defects after 20 h treatment, using Western blot to detect the Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2, the expression level of Bax. Results: Western blot results showed that A7 caused Cas H202 stimulation group Pase-3, Caspase-9 and Bax increased more significantly, Bcl-2 decreased more significantly, while Caspase-8 did not change significantly. Conclusion: autophagy and apoptosis are mutually inhibited under oxidative stress, and autophagic cell death may play a leading role in cell death.

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R776.1

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