本文選題：ROP　切入點(diǎn)：高通量測(cè)序　出處：《東南大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與意義：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity,ROP)是主要發(fā)生于早產(chǎn),低出生體重兒的一種可致盲的血管增殖視網(wǎng)膜病,也是世界范圍內(nèi)兒童致盲的主要因素。視網(wǎng)膜新生血管的形成是ROP的主要病理變化,研究已經(jīng)證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最強(qiáng)的促血管生成因子,在ROP的發(fā)生發(fā)展中其表達(dá)水平的會(huì)發(fā)生顯著的變化,因此深入探討研究這些導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管生成的因子及其調(diào)控分子的表達(dá)變化對(duì)于ROP的研究具有十分重要意義。近年來(lái),microRNA (miRNA)是一類非編碼的小RNA,自被發(fā)現(xiàn)以后就成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究結(jié)果表明miRNA作為一種重要的調(diào)控分子已經(jīng)被證實(shí)在人類許多疾病的研究中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。特別最近發(fā)現(xiàn)的同樣具有重要價(jià)值的存在于外周血液中的循環(huán)miRNA的表達(dá)情況更是受到了臨床研究者的重視。因此尋找能夠在視網(wǎng)膜血管新生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)控小分子miRNA及其相關(guān)靶基因是ROP進(jìn)一步深入研究的重要途徑。高通量DNA測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展為相關(guān)調(diào)節(jié)分子的大規(guī)模快速篩選提供了可靠的手段,新一代高通量測(cè)序技術(shù)亦被用于本論文研究中。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率雖然很高,但是從早產(chǎn)兒身上收集足夠量以及合適的分析樣本確實(shí)非常困難的事情。因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究是ROP相關(guān)疾病研究的必經(jīng)之路,ROP新生大鼠/小鼠模型的構(gòu)建方案已經(jīng)比較成熟,本研究也不例外的應(yīng)用模型大鼠來(lái)進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)與分析。ROP的致病因素很是復(fù)雜,至今也沒(méi)有完全研究清楚,但是早產(chǎn)兒吸氧已被證實(shí)是導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管新生的主要因素,從而成為ROP的主要的致病原因之一,因此本論文研究的主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象即為高氧誘導(dǎo)的ROP模型SD大鼠。綜述所示,本論文研究擬利用高通量測(cè)序手段系統(tǒng)全面的分析高氧誘導(dǎo)的ROP模型SD大鼠血漿樣本以及視網(wǎng)膜組織中miRNA的差異表達(dá)情況,隨后通過(guò)驗(yàn)證及其調(diào)控靶目標(biāo)表達(dá)水平的檢測(cè)分析,探索導(dǎo)致ROP產(chǎn)生的深層次的分子機(jī)制以及對(duì)ROP診斷治療具有潛在價(jià)值的生物分子進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估。論文研究的主要成果如下：方法與結(jié)果1)ROP模型SD大鼠的構(gòu)建及其血漿循環(huán)miRNA的高通量測(cè)序篩選論文研究首先選擇新生SD大鼠進(jìn)行高氧環(huán)境刺激,構(gòu)建ROP模型,然后通過(guò)視網(wǎng)膜血管形態(tài)及增生情況進(jìn)行模型動(dòng)物構(gòu)建成功與否的評(píng)價(jià)；隨后收集模型組和對(duì)照組外周血液樣本,分離血漿,制備模型組和對(duì)照組pool樣本,提取RNA,質(zhì)控后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和Illumina HiSeq 2500的高通量測(cè)序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1)本研究中構(gòu)建的ROP模型SD大鼠視網(wǎng)膜病變特征明顯,顯示視網(wǎng)膜血管發(fā)育滯緩,管徑變細(xì),分支減少而且有明顯擴(kuò)張迂曲,大量新生血管形成,血管密度增高,HE染色切片有很多的突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核,ROP模型鼠構(gòu)建成功；2)高通量miRNA測(cè)序結(jié)果顯示在模型鼠與對(duì)照鼠血漿中存在一些具有顯著性差異表達(dá)的miRNA,經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選共獲得上調(diào)的miRNA22種,下調(diào)的miRNA44種,所有后續(xù)深入研究涉及的miRNA將主要來(lái)源于此。此外在測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)存在5p和3p共表達(dá)的miRNA中,其表達(dá)水平的比值亦存在一定的規(guī)律性,ROP模型組與對(duì)照組之間5p/3p的比值存在一定的差異,提示其具有進(jìn)一步研究的潛在價(jià)值。2)ROP模型鼠視網(wǎng)膜組織miRNA的高通量篩選為了更加全面的了解循環(huán)miRNA與特定疾病的關(guān)系,模型鼠視網(wǎng)膜組織也被同時(shí)收集起來(lái)并提取RNA,進(jìn)行了高通量芯片篩選與生物信息分析,以期與血漿中循環(huán)miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析,更為確切地尋找ROP特異性的miRNA分子。芯片檢測(cè)結(jié)果顯示ROP模型組與對(duì)照組之間存在一些差異表達(dá)的niRNA,進(jìn)一步嚴(yán)格其篩選條件后獲得了13種上調(diào)的]miRNA和14種下調(diào)的miRNA,這些miRNA的靶基因功能富集顯示其可能與對(duì)低氧的反應(yīng)等相關(guān)的GO功能及調(diào)控通路有關(guān),為進(jìn)一步分析研究血漿中miRNA的差異表達(dá)情況提供了重要的參考。3)循環(huán)niRNA差異表達(dá)情況的分析、驗(yàn)證與部分相關(guān)基因功能的研究差異表達(dá)miRNA的篩選不是最終目標(biāo),其確切的功能及其在ROP中可能的作用機(jī)制才是論文研究的主要目標(biāo),因此初步篩序獲得的循環(huán)miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的生物信息分析,包括靶基因預(yù)測(cè),GO功能富集和KEGG調(diào)控通路分析。針對(duì)前期測(cè)序和后續(xù)生物信息分析的結(jié)果,部分差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了定量PCR的驗(yàn)證；同時(shí)檢測(cè)了相關(guān)的靶基因在模型組和對(duì)照組之間的mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異。還針對(duì)個(gè)別靶基因VEGF和GABA與miRNA的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了深入的分析與探討,VEGF與 GABA均已被證實(shí)與ROP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中缺氧環(huán)境有關(guān)。最后通過(guò)比較分析視網(wǎng)膜組織和循環(huán)miRNA的差異表達(dá)情況,篩選出來(lái)4種具有共表達(dá)趨勢(shì)的miRNA,并且在早產(chǎn)兒病例中進(jìn)行了定量PCR驗(yàn)證分析。本部分研究結(jié)果如下：1)篩選出其中10種包含有高豐度表達(dá)、低豐度表達(dá)、高差異倍數(shù)、低差異倍數(shù)以及上調(diào)和下調(diào)的miRNA的表達(dá)情況都在定量PCR的驗(yàn)證結(jié)果中得到了證實(shí),三種miRNA 5p/3p的比值也在對(duì)應(yīng)的分析中發(fā)現(xiàn)與測(cè)序結(jié)果一致；2)生物信息分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格條件篩選的14種miRNA利用兩種靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)能夠獲得594種共同的靶基因,對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)都參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞移行、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生物合成等且于血管新生密切相關(guān)的過(guò)程,同時(shí)還參與了細(xì)胞因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、趨化因子以及MAPK和TGF-β的信號(hào)調(diào)節(jié)通路的正向調(diào)控,細(xì)胞間的細(xì)胞傳遞等；3)血漿VEGF和血漿GABA的水平分析發(fā)現(xiàn),miRNA參與了這些關(guān)鍵的靶基因的表達(dá)調(diào)控,而且它們之間存在著相互協(xié)調(diào)、相互制衡的復(fù)雜關(guān)系,其中諸如miR-351、miR-200b等就共同靶向VEGF與GABA,提示這些miRNA可以作為潛在的ROP的治療靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究和探索；4)視網(wǎng)膜組織與血漿共表達(dá)的niRNA在3例早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中得到了證實(shí),在另外兩例中發(fā)現(xiàn)了一些不一致現(xiàn)象,其中一例伴有先天性心臟病,因此提示這些差異表的miRNA可能還同時(shí)參與了先天性心臟病等相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)控制。結(jié)論：綜上所述,本論文研究利用高通量測(cè)序手段獲得了一些差異表達(dá)的miRNA,部分miRNA在定量PCR中獲得了證實(shí)；這些miRNA參與調(diào)控的與ROP密切相關(guān)的靶基因的表達(dá)情況也在論文中進(jìn)行了研究與探討；與視網(wǎng)膜組織相比較發(fā)現(xiàn)了一些共表達(dá)的miRNA,這些miRNA在幾個(gè)典型的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變病例中得到了驗(yàn)證。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R774.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 歐陽(yáng)麗娟;皮練鴻;;早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變治療研究進(jìn)展[J];激光雜志;2015年02期

2 張國(guó)慶;李菁;步軍;孫建華;黃萍;;熊去氧膽酸治療新生大鼠視網(wǎng)膜損害初探[J];臨床兒科雜志;2014年12期

3 陳剛;宋軍;相虹;張璐潔;呂進(jìn)泉;;γ氨基丁酸對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織VEGF、MMP-9表達(dá)的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2014年30期

4 田麗麗;任兵;高曉唯;;早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變治療新進(jìn)展[J];國(guó)際眼科雜志;2014年02期

5 鄧彭博;胡成平;熊曾;楊華平;李園園;;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯通過(guò)Ang-1與Ang-2比例重調(diào)引起NSCLC組織間液壓降低、乏氧減輕并促進(jìn)化療療效(英文)[J];中國(guó)天然藥物;2013年03期

6 華靜;茅雙根;;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)傳導(dǎo)通路在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中的作用[J];國(guó)際兒科學(xué)雜志;2013年01期

7 李秋平;王宗華;章晟;陳穎;陳佳;黃俊謹(jǐn);王自珍;柯艷;封志純;;新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房床旁激光治療嚴(yán)重早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變103例報(bào)告[J];中華兒科雜志;2013年01期

8 劉新蘭;段瑜;魏建敏;;Ang-2、Tie-2和VEGFR-2在胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J];寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年12期

9 張俊清;;γ-氨基丁酸A受體及受體基因在大鼠急性腦缺血中的變化[J];中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志;2012年21期

10 賴天寶;李Z，

本文編號(hào)：1620589