本文選題：先天性白內(nèi)障　切入點(diǎn)：基因突變　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 先天性白內(nèi)障是是目前世界范圍內(nèi)兒童盲的主要原因。約半數(shù)的兒童先天性白內(nèi)障是由遺傳因素決定的。本研究旨在報(bào)道一個(gè)先天性核性白內(nèi)障的中國(guó)家系,對(duì)其進(jìn)行疾病相關(guān)候選基因定位及功能研究。 方法： 本實(shí)驗(yàn)研究一個(gè)在浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科中心收集的先天性白內(nèi)障家系。對(duì)該家系成員進(jìn)行詳細(xì)的病史調(diào)查和眼科檢查,包括視力、裂隙燈、散瞳眼底、眼壓、角膜曲率、角膜地形圖、OCT和A/B超檢查等。采集該家系的患者、健康成員和100名正常對(duì)照者的外周靜脈血,提取基因組DNA。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增相關(guān)的候選基因的全部編碼區(qū)域及內(nèi)含子、外顯子交界區(qū)五十個(gè)堿基對(duì)以上區(qū)域。擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序,并進(jìn)行序列分析。借助SIFT,PolyPhen-2和Condel等生物信息學(xué)方法對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析。通過(guò)PCR方法從人眼cDNA文庫(kù)中完整克隆出aA晶狀體蛋白的編碼序列,采用pET21b和pEGFP-C3質(zhì)粒分別構(gòu)建原核及真核的野生型(CRYAAwt-pET21b、CRYAAwt-pEGFP-C3)及突變型(CRYAAmut-pET21b、CRYAAmut-pEGFP-C3) αA晶狀體蛋白表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法對(duì)純化后的目標(biāo)蛋白進(jìn)行研究,檢測(cè)突變前后目標(biāo)蛋白的理化特性變化情況。使用野生型及突變型的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位以及聚集情況。 結(jié)果： 家系中患者白內(nèi)障表型為核性網(wǎng)狀渾濁,不伴其他眼部及系統(tǒng)性疾病。該家系的疾病遺傳方式為常染色體顯性遺傳。檢測(cè)候選基因發(fā)現(xiàn)了一個(gè)發(fā)生在CRYAA基因編碼區(qū)的第161位堿基由鳥(niǎo)嘌呤變?yōu)樾叵汆奏?c.161GT)的雜合改變,該變化導(dǎo)致了一個(gè)高度保守的精氨酸密碼子變?yōu)榱涟彼崦艽a子(p.R54L).該堿基改變?cè)诩蚁抵泄卜蛛x,而不存在于對(duì)照組100名中國(guó)漢族健康者。PolyPhen-2及Condel提示p.R54L突變?yōu)榭赡苡绊懙鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的有意義的突變。 我們發(fā)現(xiàn)p.R54L突變蛋白通過(guò)增大其寡聚體大小從而影響其四級(jí)構(gòu)象。p.R54L突變使αA晶狀體蛋白色氨酸內(nèi)源性熒光的溶解暴露增加,外源ANS熒光減少,并且降低了該蛋白的分子伴侶活性。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CRYAAwt-pEGFP-C3、 CRYAAmut-pEGFP-C3質(zhì)粒,在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)野生型及突變型蛋白后發(fā)現(xiàn)突變蛋白有明顯的聚集現(xiàn)象,這可能與其分子伴侶活性降低相關(guān),說(shuō)明分子伴侶活性減低很可能是該突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的原因。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)了與核性先天性白內(nèi)障相關(guān)的CRYAA基因錯(cuò)義突變(c.161GT, p.R54L),證實(shí)αA晶狀體蛋白R(shí)54L突變可導(dǎo)致其理化性質(zhì)及分子伴侶活性改變及蛋白胞質(zhì)內(nèi)聚集。本研究拓展了現(xiàn)有的先天性白內(nèi)障的表型譜,強(qiáng)調(diào)了N端對(duì)于調(diào)控αA晶狀體蛋白寡聚體大小及分子伴侶功能的重要性,揭示了αA晶狀體蛋白突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障發(fā)病的機(jī)制,為先天性白內(nèi)障的預(yù)防和基因治療提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective:
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本文編號(hào)：1619604