本文選題：視網(wǎng)膜新生血管　切入點：金納米棒　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分金納米棒抑制新生血管形成的作用研究目的研究金納米棒(Gold nanorods,GNRs)被細胞內(nèi)吞的途徑及其特異性抑制體外血管形成的作用及機制。方法利用種子生長法合成GNRs并進行聚乙二醇修飾(PEGYlated GNRs),并檢測合成的GNRs各項表征及在細胞培養(yǎng)基中表征的變化。我們進一步利用化合物抑制劑和小干擾RNA研究GNRs入胞的機制;采用細胞增殖、細胞遷移及管樣形成等方法研究GNRs對HREC功能的影響;利用激光共聚焦檢測GNRs對HREC細胞骨架的影響;利用流式細胞儀檢測GNRs對HREC細胞周期的影響;最后利用Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果我們利用改進的種子生長法合成列縱橫比大、純度高的GNRs,并成功修飾巰基聚乙二醇,該納米棒可以吸附細胞培養(yǎng)基及細胞分泌的蛋白形成蛋白暈,該蛋白暈進一步改變了GNRs的特性。GNRs入胞的機制是時間依賴的,不同時間機制不同。同時,我們發(fā)現(xiàn)該GNRs可以特異性抑制HREC的增殖、遷移、管樣形成及引起HREC細胞骨架的變化。其抗血管功能是通過抑制HREC細胞周期于G1期,并抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達。結(jié)論GNRs通過誘導細胞周期阻滯特異性抑制內(nèi)皮細胞增殖而對其它細胞無影響,使其在治療新生血管疾病上展現(xiàn)很大潛力。第二部分氧化亞銅納米粒抑制新生血管形成的作用研究探索氧化亞銅納米粒(Cuprous oxide nanoparticles,CO-NPs)對新生血管生成的影響及其可能機制。目的方法利用液相氧化還原法合成CO-NPs并利用Ed U試劑盒檢測CO-NPs對臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖的影響;用倒置相差顯微鏡觀察CO-NPs處理后HUVEC形態(tài)的變化;利用Transwell實驗檢測CO-NPs對HUVEC遷移能力的影響;利用管樣形成實驗檢測CO-NPs對HUVEC管樣形成能力的影響;利用體外注射Matrigel膠實驗檢測CO-NPs對體外新生血管形成能力的影響;流式細胞儀檢測CO-NPs對細胞周期和凋亡的影響;利用Western blot和RT-PCR檢測CO-NPs抑制體外新生血管形成的機制。結(jié)果合成的CO-NPs具有丁達爾現(xiàn)象、粒徑約60nm并且?guī)в姓姾?CO-NPs處理后死亡細胞顯微鏡下呈現(xiàn)透亮變圓的形態(tài);CO-NPs可以明顯抑制HUVEC的增殖、遷移及體內(nèi)外血管生成。CO-NPs可以明顯抑制細胞周期于S期并促進細胞凋亡。CO-NPs抑制新生血管的機制是通過下調(diào)血管生成因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)的表達。結(jié)論CO-NPs通過特異性抑制VEGFR2表達發(fā)揮其抗血管作用,可能成為靶向治療新生血管性疾病的新物質(zhì)。第三部分干擾膜聯(lián)蛋白A2受體抑制新生血管形成的作用研究目的探索干擾AXⅡR表達后對體外新生血管形成的影響及其可能機制。方法Western blot和RT-PCR檢測脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AXⅡR后的干擾效率。利用Ed U實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC增殖的影響;利用Transwell實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC遷移能力的影響;通過細胞粘附實驗檢測干擾AXⅡR后HUVEC粘附能力的改變;利用管樣形成實驗檢測干擾AXⅡR對HUVEC管樣形成能力的影響;體外注射Matrigel膠實驗檢測干擾AXⅡR對體外新生血管形成能力的影響;流式細胞儀檢測干擾AXⅡR后對細胞周期和凋亡的影響;最后用Western blot和RT-PCR檢測干擾AXⅡR后抑制體外新生血管形成的機制。結(jié)果AXⅡR在HUVEC中表達,并且si AXⅡR可以明顯抑制AXⅡR在m RNA和蛋白水平的表達;si AXⅡR可以明顯抑制HUVEC的增殖、遷移、粘附及體內(nèi)外血管生成。si AXⅡR可以明顯抑制細胞周期于S期而對細胞凋亡無明顯影響;最后我們證明si AXⅡR通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases)2和9的表達進而發(fā)揮抑制新生血管的作用結(jié)論本研究表明AXⅡR血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、黏附等方面發(fā)揮重要作用,可能成為治療新生血管的新靶點。第四部分氧化亞銅納米粒抑制葡萄膜黑色素瘤的作用研究目的探索CO-NPs對脈絡(luò)膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)的影響及可能的機制。方法利用Western blot和蛋白質(zhì)譜分析研究了CO-NPs與細胞共孵育后表征的變化;利用CCK-8實驗檢測了CO-NPs對UM細胞系(C918)、人腎癌細胞系(A498)、視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal pigment epithelium cell,RPE)和人胚腎細胞(293T)增殖的影響;利用Transwell小室檢測了C918細胞的遷移和侵襲能力;利用激光共聚焦檢測了C918形態(tài)的變化;利用化學抑制劑探索了C918內(nèi)吞CO-NPs的途徑;.利用投射電鏡探索了CO-NPs在C918細胞內(nèi)的定位;利用流式細胞儀檢測CO-NPs對線粒體膜電位的影響;利用TUNEL實驗檢測CO-NPs對細胞凋亡的影響;利用激光共聚焦檢測CO-NPs對細胞自噬的影響;最后利用Western blot檢測CO-NPs對細胞自噬和凋亡的影響結(jié)果CO-NPs與細胞孵育后可以吸附血清中的蛋白,使得CO-NPs電位由正變負;CO-NPs可以特異性的抑制腫瘤細胞增殖而對正常細胞無影響;CO-NPs可以濃度依賴的抑制C918細胞的遷移和侵襲并改變細胞骨架結(jié)構(gòu);CO-NPs主要通過脂筏結(jié)構(gòu)進入細胞,并定位于自噬體和線粒體;CO-NPs可以導致線粒體功能異常并誘導產(chǎn)生活性氧;CO-NPs可以誘導細胞凋亡并促進凋亡相關(guān)蛋白活化;CO-NPs可以促進細胞自噬并影響相關(guān)蛋白表達。結(jié)論CO-NPs可以特異性抑制UM細胞遷移和侵襲,有望成為治療UM的新方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R774.1

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本文編號：1585838