本文關(guān)鍵詞： N-對甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮 晶狀體上皮細(xì)胞 硫醇轉(zhuǎn)移酶 硫氧還蛋白氧化損傷 泛素-蛋白酶體通路　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：白內(nèi)障是目前世界上影響人類健康的常見病，也位列我國第一位致盲的疾病，，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。白內(nèi)障的發(fā)生與多種因素有關(guān)，是多種因素綜合作用的結(jié)果。比如晶狀體蛋白的基因突變、晶狀體遭受氧化損傷、輻射損傷、老化變性、葡萄糖過度刺激、半乳糖等代謝障礙、脂質(zhì)過氧化損傷等均可對晶狀體的正常功能造成不同程度的損傷，結(jié)果導(dǎo)致晶狀體發(fā)生混濁，影響晶狀體對光的透射和折射，從而造成視物不清。 氧化應(yīng)激是由活性氧（ROS）誘導(dǎo)的一種與老化密切相關(guān)的損傷類型，與老年性白內(nèi)障的形成有關(guān)，被認(rèn)為是白內(nèi)障的始發(fā)因素。晶狀體產(chǎn)生的主要活性氧分子包括超氧負(fù)離子、羥自由基和H2O2；內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧的結(jié)構(gòu)包括NADPH氧化酶，線粒體和過氧化物酶體，兩種主要產(chǎn)生內(nèi)源性活性氧的途徑是紫外線和離子輻射。晶狀體中通過這些途徑產(chǎn)生的ROS分子可以經(jīng)由抗氧化劑和氧化防御系統(tǒng)中和，因此晶狀體中具備這兩大修復(fù)系統(tǒng)來重塑損傷分子或者減輕損傷程度。硫醇轉(zhuǎn)移酶（thioltransferase, TTase）、硫氧還蛋白（thioredoxin, Trx）和硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase, TR）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase, GR）系統(tǒng)被認(rèn)為是哺乳動物組織中強(qiáng)有力的蛋白修復(fù)系統(tǒng)。近年的研究顯示TTase/GR和Trx/TR均存在于晶狀體中，對保持晶狀體的透明性有重要的作用。 晶體蛋白是哺乳動物晶狀體細(xì)胞質(zhì)中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)其在電場中的遷移能力主要分為α、β、γ三大類。目前對α晶體蛋白的功能研究比較深入，它的分子伴侶作用已得到世界公認(rèn)，γ晶體蛋白主要承擔(dān)維持晶狀體正常形態(tài)的作用，然而對β晶體蛋白的研究還較少，以往認(rèn)為其與γ晶體蛋白一樣作為晶狀體的結(jié)構(gòu)蛋白存在，近年來β晶體蛋白成為研究熱點(diǎn)，我們前期研究表明了它對維持晶狀體的透明性和屈光度有一定的作用。晶體蛋白中均含有一定數(shù)量的半胱氨酸（Cys, αB除外），尤其是β、γ類含量較高，Cys含一游離的巰基（-SH），對于氧化極為敏感；巰基經(jīng)氧化作用形成二硫鍵混合物，是晶體蛋白去折疊、聚集增強(qiáng)的主要?jiǎng)右�。由此產(chǎn)生一對矛盾：氧化應(yīng)激會使巰基氧化，而為了保持晶狀體的透光性，晶體蛋白必須維持足夠量的還原狀態(tài)的巰基（-SH）。 晶體蛋白的翻譯后修飾（post-translational modifiction, PTM）是白內(nèi)障發(fā)病的主要誘因。晶狀體是一種結(jié)構(gòu)極為特殊的器官：透明、缺乏血供，晶體蛋白缺乏轉(zhuǎn)化更新、形成后即伴隨終生。使晶體蛋白遭受PTM的可能性遠(yuǎn)較其它類蛋白大。PTM對晶體蛋白的主要影響是：極易引發(fā)晶體蛋白去折疊、改變蛋白原有構(gòu)象；二硫鍵形成、晶體蛋白之間非特異交聯(lián)，蛋白水溶性下降；聚集增強(qiáng)形成高分子量物質(zhì)（High molecular weight, HMW），當(dāng)HMW聚集達(dá)到1×107Da以上時(shí)，即可發(fā)生光散射，晶體失去透明性、發(fā)生白內(nèi)障。 那么如何保持晶體蛋白中-SH未被氧化交聯(lián)為二硫鍵，進(jìn)而阻斷后續(xù)蛋白分子交聯(lián)、聚集、沉淀，對維持晶體透光性及防治老年性白內(nèi)障起著關(guān)鍵的作用 本課題組前期的研究成果表明了二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT，分子式為C4H10O2S2）具有良好的抗晶狀體蛋白變性的作用，DTT是一類化學(xué)性質(zhì)的還原劑，它可以解開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵，作為巰基的保護(hù)劑，能夠抑制晶狀體蛋白的熱變性及非特異性聚集沉淀。課題組前期研究顯示出在用自行配制的DTT滴眼液第8天后能使硒性白內(nèi)障小鼠模型晶狀體混濁的程度減輕。而且我們研究也顯示出DTT對紫外線性白內(nèi)障大鼠模型具有良好的抑制作用。DTT不僅可以防止蛋白質(zhì)分子間形成二硫鍵，并且可以和蛋白質(zhì)競爭性結(jié)合-SH，因此在預(yù)防和治療方面都發(fā)揮了一定的作用。前期實(shí)驗(yàn)也初步驗(yàn)證了異丙醇對晶體蛋白巰基的烷基化作用，通過封閉部分巰基，抑制了二硫化合物的形成。 能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的巰基進(jìn)行烷基化的試劑有很多，我們篩選出了一些化合物，例如叔丁醇(Tert-butyl alcohol, TAB)、2-SH-3-丁醇、N-對甲苯磺基-L苯乙胺酰氯甲基酮、甲苯磺胺氯甲基酮等等，其中叔丁醇對硒性白內(nèi)障的治療作用也得到了我們初步的證實(shí)。N-對甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮（N-tosyl-L-phenylalanyl-chloromethylketone, TPCK），研究已經(jīng)證實(shí)能夠抑制細(xì)胞的凋亡以及抗炎等作用對腦缺血有一定的治療效果并初步應(yīng)用于臨床。對甲苯磺�；═osyl, Ts）是一個(gè)由對甲苯磺酸衍生出的取代基，它是一個(gè)親電子基，常用作醇羥基的保護(hù)基；而甲基酮作為烷化劑可以封閉晶體蛋白暴露出的巰基，抑制蛋白之間的聚合，因此可以阻止和延緩晶狀體的混濁程度。 基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首先將離體培養(yǎng)晶狀體并模擬氧化應(yīng)激的環(huán)境，加入TPCK干預(yù)后，觀察TPCK對晶狀體混濁程度的抑制作用，檢測其中酶含量的變化，觀察細(xì)胞凋亡的情況，研究TPCK抗氧化損傷的效果，研究其機(jī)制。 此外，泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）是Hershko等發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高效率蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，目前國內(nèi)外對于UPP的研究主要集中在腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及治療學(xué)方面，是蛋白質(zhì)的選擇性降解中一項(xiàng)非常重要的機(jī)制；研究發(fā)現(xiàn)該通路介導(dǎo)的細(xì)胞蛋白降解是一個(gè)非常復(fù)雜而縝密的調(diào)控過程，是細(xì)胞調(diào)控的重要機(jī)制，通過降解細(xì)胞各通路的抑制因子和（或）激活因子發(fā)揮著上調(diào)或下調(diào)作用。最新有實(shí)驗(yàn)研究出晶狀體上皮細(xì)胞中也含有UPP系統(tǒng)的所有組成部分，大約有40～50%受損的晶體蛋白可以通過UPP進(jìn)行降解。UPP系統(tǒng)是晶狀體中主要的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系，它可以通過選擇性地降解受損的晶狀體蛋白，還能發(fā)揮有條件地降解與細(xì)胞內(nèi)多種生物過程相關(guān)的調(diào)控蛋白的作用，參與晶狀體的發(fā)育與分化。近年來，UPP作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)非溶解體性降解的主要途徑已受到人們的日益重視，但UPP在白內(nèi)障的研究目前仍處于起步階段。 本課題第三部分內(nèi)容研究UPP對晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)水平的影響，探討其是否能夠清除受損變性的晶體蛋白。我們擬通過原代培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞，對UPP活性和白內(nèi)障形成及受損蛋白之間的關(guān)系進(jìn)行初步評估，以期得到抗白內(nèi)障的作用機(jī)理。總之本課題為白內(nèi)障藥物防治的臨床前期研究提供可靠的理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且這將對于其它年齡相關(guān)性眼部疾病的防治也有重要的參考價(jià)值。 第一部分TPCK對晶狀體氧化應(yīng)激下混濁程度和熱穩(wěn)定性的影響 目的：探討TPCK在培養(yǎng)的大鼠離體晶狀體中抵抗氧化應(yīng)激的能力及對晶狀體蛋白熱穩(wěn)定性的影響。方法：取完整晶狀體用H2O2誘導(dǎo)其氧化損傷，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察完整晶狀體在氧化損傷組和用TPCK干預(yù)組的混濁程度。檢測不同組的晶狀體蛋白的熱穩(wěn)定性的變化；結(jié)果：未加入TPCK僅用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的晶體混濁程度高于TPCK用藥組；晶狀體蛋白吸光度值在用TPCK藥物組低于氧化損傷組且上升速度緩慢。結(jié)論：TPCK能夠在一定程度上減輕晶狀體氧化應(yīng)激狀態(tài)下混濁程度的發(fā)生并穩(wěn)定晶狀體蛋白。 第二部分TPCK對晶狀體氧化應(yīng)激中抗氧化酶和凋亡的影響 目的：探討H2O2誘導(dǎo)晶狀體氧化損傷用TPCK干預(yù)后對抗氧化酶含量的影響及TPCK對細(xì)胞凋亡的作用。方法：同第一部分采用晶狀體離體培養(yǎng)的方法加入H2O2引起氧化損傷，另加入TPCK干預(yù)，對照組晶狀體僅用TC-199培養(yǎng)劑。在不同時(shí)間點(diǎn)分別取晶狀體測定TTase、Trx的變化并觀察TUNEL凋亡的情況；另原代培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞（Lens epithelial cells, LES），紫外線誘導(dǎo)凋亡后觀察TPCK的影響。結(jié)果：氧化應(yīng)激后第3hr兩組的TTase、Trx都有顯著的提高，第6hr氧化損傷的晶狀體中這兩種酶的含量減少，TPCK組的TTase、Trx含量低于正常對照組但明顯高于氧化損傷組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TUNEL凋亡提示，在培養(yǎng)3hr的晶狀體上皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡在H2O2損傷組最多，TPCK組較少；細(xì)胞培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞流式凋亡檢測顯示TPCK組細(xì)胞胞亡數(shù)少于氧化應(yīng)激組。結(jié)論：TPCK可減少大鼠晶狀體的氧化損傷時(shí)的程度。 第三部分UPP對晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)水平的影響 目的：探討過度表達(dá)UPP的限速成分Ubc4對晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)水平的影響。方法：采用原代培養(yǎng)的方法體外培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞，經(jīng)UPP通路的上調(diào)因子miRNA Ubc4轉(zhuǎn)染到傳代的晶狀體上皮細(xì)胞中，檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對抗環(huán)境應(yīng)激能力的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染Ubc4上調(diào)UPP的活性后的晶狀體上皮細(xì)胞中受損的晶狀體蛋白αA1-162（是αA晶狀體蛋白的降解片段，容易聚集沉淀；αA晶狀體蛋白是一種公認(rèn)的保護(hù)性晶狀體蛋白，該蛋白受損遭到降解后其保護(hù)作用降低）的含量明顯少于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的水平。結(jié)論：轉(zhuǎn)染siRNA Ubc4后的晶狀體上皮細(xì)胞中的αA降解片段（αA1-162）含量減少，有助于防止受損蛋白質(zhì)的聚集沉淀，進(jìn)而在晶狀體受到氧化應(yīng)激的損傷時(shí)混濁變性具有一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R776.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1498893