目的:本研究構(gòu)建了攜帶血小板反應(yīng)素-1(Thrombospondin-1,TSP-1)基因的腺病毒,通過移植轉(zhuǎn)染了攜帶TSP-1基因的腺病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow stem cells,BMSCs)到脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)部位,探討 TSP-1 基因修飾的BMSCs(BMSCs+TSP-1)在脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中的作用及其潛在機(jī)制。方法:首先進(jìn)行目的基因序列的合成,通過雙酶切獲取目的基因片段,采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)以及基因測(cè)序技術(shù)對(duì)獲取的目的基因片段進(jìn)行鑒定,然后通過293細(xì)胞制備和擴(kuò)增腺病毒。制備好的腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞,通過熒光顯微鏡和免疫印跡鑒定轉(zhuǎn)染效率和TSP-1的表達(dá)變化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Ventral spinal cord 4.1,VSC4.1)進(jìn)行氧糖剝奪來模擬脊髓損傷后損傷部位神經(jīng)元遭受的缺氧缺糖的微環(huán)境,將受損的神經(jīng)元分別與不含細(xì)胞的培養(yǎng)基、正常的BMSCs、BMSCs + TSP-1進(jìn)行共培養(yǎng),通過免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)GAP-43...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１目的基因ＴＳＰ－１雙酶切產(chǎn)物

３．１．目的基因片段的合成與純化??合成目的基因序列，用Ｎｏｔｌ和ＥｃｏＲＩ雙酶切基因獲得ＴＳＰ－１片段，酶切完??成后膠回收。ＤＮＡ電泳結(jié)果顯示種基因的擴(kuò)增片段與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致（圖１）。??用潔凈的刀片在紫外線燈下將相應(yīng)片段切取出來。并將膠塊中無ＤＮＡ的膠塊去除??掉，最后完....

圖２?ＴＳＰ－１重組腺病毒質(zhì)粒單克隆的ＰＣＲ鑒定

將轉(zhuǎn)化后的ＴＳＰ－１平板進(jìn)行挑菌，在３７°Ｃ下以２５０轉(zhuǎn)／分鐘的轉(zhuǎn)速進(jìn)行??搖菌］４小時(shí)，然后取菌液進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，單克�。校茫诣b定連接產(chǎn)物與預(yù)期一致??（圖２）。將陽性克隆菌液送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序比對(duì)結(jié)果（圖??３）顯示合成序列與ＴＳＰ－１的序列完全一致。??２....

圖４擴(kuò)增病毒的細(xì)胞的形態(tài)

到１０ｃｍ的細(xì)胞培養(yǎng)皿中（細(xì)胞密度９０％以上），兩天后，所有細(xì)胞脫落底面時(shí)進(jìn)??行病毒收集，方法如上，然后取上清進(jìn)行下一代病毒的擴(kuò)增或者保存到－８０°Ｃ。之￥??后的病毒擴(kuò)增及收集如上反復(fù)進(jìn)行（圖４Ｅ，Ｆ）。??２３??

圖５腺病毒轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

圖５腺病毒轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)。Ａ為ＢＭＳＣｓ光鏡照片，Ｂ為轉(zhuǎn)染ＧＦＰ對(duì)照腺病毒的??ＢＭＳＣｓ，Ｃ為轉(zhuǎn)染ＴＳＰ－１過表達(dá)腺病毒的ＢＭＳＣｓ，Ｄ為ＷＢ?lián)鞙y(cè)ＴＳＰ－１的表迗情??況。??Ｆｉｇｕｒｅ?５?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ａｄｅｎｏｖｉｍｓ?ｔｒａｎｓ....

本文編號(hào)：3962271