目的:軟組織缺損的修復(fù)重建一直是整形外科所面臨的難題和挑戰(zhàn),目前臨床常用的軟組織修復(fù)方式主要是應(yīng)用自體的皮瓣移植、游離脂肪移植和異體材料填充等,但這些方法均存在弊端。利用種子細(xì)胞和支架材料所構(gòu)建的組織工程脂肪,被認(rèn)為更適用于軟組織的修復(fù)重建。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix ECM)是由組織細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間隙中的大分子物質(zhì),在細(xì)胞間起連接支持的作用,并能調(diào)節(jié)細(xì)胞的各類生理活動(dòng)。目前已能從多種組織中分離提取出不同的細(xì)胞外基質(zhì),如豬小腸黏膜下層和脫細(xì)胞真皮,其衍生的生物制品已被應(yīng)用于臨床。但這些生物制品大多取自動(dòng)物或人的尸體,難以避免病原體傳播及免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。脂肪組織作為一種疏松的結(jié)締組織,除含有多種的細(xì)胞成分外,還富含大量細(xì)胞外基質(zhì),這些細(xì)胞外基質(zhì)在維持脂肪組織的結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮重要的作用。脂肪組織可以通過吸脂手術(shù)的方式從人體獲取,吸脂手術(shù)是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的整形外科手術(shù)之一,對患者造成的創(chuàng)傷小,恢復(fù)快,易于被接受。支架材料是組織工程技術(shù)的核心和關(guān)鍵,為細(xì)胞生長和組織再生提供空間構(gòu)架,同時(shí)還參與種子細(xì)胞的黏附、增殖、遷移及新生血管的形成。已有研究者將不同組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建成具有三維立體形態(tài)的生物活性支架,但這些支架多需要外科手術(shù)的方式將其植入體內(nèi),無法避免植入時(shí)的創(chuàng)傷。軟組織缺損的形態(tài)多不規(guī)則,可注射的水凝膠支架形態(tài)更適用于軟組織缺損的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)將吸脂手術(shù)獲取人體脂肪,通過物理,化學(xué)及酶制劑相結(jié)合的脫細(xì)胞方法,獲取到脫細(xì)胞的脂肪組織(Decellularized adipose tissue DAT),并將其構(gòu)建成可注射的水凝膠支架。對脂肪脫細(xì)胞水凝膠支架的成分,理化性質(zhì)及體內(nèi)外生物相容性等進(jìn)行檢測,探討其用于脂肪組織工程支架的可行性,從而為軟組織缺損的修復(fù)重建提供新的解決方案。研究方法:1、采用物理,化學(xué)和酶學(xué)相結(jié)合的脫細(xì)胞方法,為吸脂手術(shù)獲取到的人體脂肪組織脫細(xì)胞,對提取到的脫細(xì)胞脂肪組織分別進(jìn)行HE染色,DAPI染色、油紅O染色及DNA定量檢測,評估其脫細(xì)胞的有效性;進(jìn)行膠原纖維、網(wǎng)狀纖維、彈力纖維的特異性染色及I型、IV型膠原蛋白,層連蛋白,纖連蛋白的免疫組織化學(xué)染色,及膠原蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycans GAG)的定量測定,評估DAT中ECM不同成分的保留情況。2、利用膠原酶消化法,分離出人脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells ADSCs),進(jìn)行傳代培養(yǎng),測定細(xì)胞增殖的情況,繪制生長曲線,進(jìn)行成脂成骨定向誘導(dǎo)分化。3、將提取的脫細(xì)胞脂肪組織,經(jīng)凍干后研磨成粉,在HCl和胃蛋白酶混合溶液作用下溶解,經(jīng)體外調(diào)節(jié)pH值中性后,制備出DAT水凝膠支架。對水凝膠的超微結(jié)構(gòu),可注射性及體外的凝膠化過程進(jìn)行觀察,同時(shí)制備鼠尾腱I型膠原水凝膠支架與其進(jìn)行對比,進(jìn)行凝膠濁度動(dòng)力學(xué)檢測和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并觀察DAT水凝膠植入大鼠體內(nèi)后的凝膠化過程。4、將第3代ADCSs在體外接種到DAT水凝膠支架,觀察細(xì)胞在支架表面的活性及增殖情況,并對復(fù)合支架的ADCSs進(jìn)行成脂誘導(dǎo),觀察支架對ADCSs成脂能力的影響。再將DAT水凝膠支架注射進(jìn)大鼠皮下后,不同時(shí)間段取材,觀察植入的水凝膠支架在體內(nèi)的大體形態(tài)變化,將組織切片進(jìn)行HE染色,masson染色及CD45、CD68的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果:1、DAT的提取及鑒定:吸脂手術(shù)獲取的人體脂肪組織,經(jīng)一系列脫細(xì)胞方法處理后,提取出的脫細(xì)胞脂肪組織,外觀呈不透明的乳白色,質(zhì)地柔軟,無固定形態(tài);HE及DAPI染色無可見細(xì)胞核,殘留的DNA含量極其微少;組織學(xué)染色可見膠原纖維,網(wǎng)狀纖維,彈力纖維的存在,免疫組化染色結(jié)果顯示DAT中的I、IV型膠原蛋白,層連蛋白,纖連蛋白均得以保留;膠原蛋白和GAG定量檢測提示這兩種成分均存在于脫細(xì)胞的組織中,但含量略有減少。2、ADSCs的分離培養(yǎng)鑒定:利用膠原酶消化法分離出ADSCs,通過貼壁生長去除未黏附細(xì)胞,ADSCs的生長曲線呈S型,細(xì)胞具有自我更新能力,傳到第10代仍保持良好的增殖狀態(tài)。細(xì)胞在一定條件下,能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。3、DAT水凝膠支架的構(gòu)建及性能檢測:構(gòu)建的DAT水凝膠支架在體外4℃時(shí)能順利通過18G針頭,在體內(nèi)外37℃條件下,能自主聚合形成凝膠。形成的凝膠具有多孔三維結(jié)構(gòu),含有包括I型膠原蛋白在內(nèi)的多種肽類成分,凝膠的特性隨濃度不同而不同,高濃度的凝膠具有更牢固的外形,開始形成凝膠的時(shí)間更早,成膠的速率也更快。4、DAT水凝膠支架體內(nèi)外生物相容性檢測:DAT水凝膠支架,體外復(fù)合ADSCs培養(yǎng)對細(xì)胞無毒性作用,能促進(jìn)ADSCs的生長增殖,并能自發(fā)誘導(dǎo)ADSCs向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。植入體內(nèi)后,早期可引起輕微炎癥反應(yīng),隨時(shí)間延長,炎癥反應(yīng)逐漸消失,宿主細(xì)胞開始向支架內(nèi)部遷徙,并伴有新生血管和脂肪組織形成。結(jié)論:1、采用物理、化學(xué)和酶學(xué)結(jié)合的脫細(xì)胞方法,能夠從吸脂來源的人體脂肪中提取DAT,提取的DAT中有效去除了脂肪組織中的細(xì)胞及脂質(zhì)成分,保存脂肪ECM中的絕大部分成分。2、DAT能被構(gòu)建成可注射的水凝膠支架,在體內(nèi)外一定條件下能自主聚合形成凝膠。形成的凝膠支架具有多孔的三維結(jié)構(gòu),具有更為復(fù)雜的的蛋白成分,凝膠的理化性質(zhì)隨濃度的不同而改變。3、DAT水凝膠支架具有良好的生物相容性,在體外能促進(jìn)ADSCs的增殖與成脂,植入大鼠體內(nèi)能促進(jìn)宿主細(xì)胞的遷徙及新生脂肪和血管形成,有望成為脂肪組織工程的理想的支架和軟組織缺損的最佳填充材料。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08;R622
【部分圖文】：

3 結(jié)果3.1 人脂肪組織脫細(xì)胞過程及大體形態(tài)觀察吸脂抽取物靜止分層后收集到的脂肪組織（圖 1，A），經(jīng)高低滲透壓液體反復(fù)浸泡振蕩及多次凍融循環(huán)后，可見脂肪顏色變淺，組織疏松，類糜狀，表面有大量脂滴漂浮（圖 1，B）。凍融后的組織經(jīng)勻漿離心后，可分為三層，上層為細(xì)胞破壞后分離出來的游離脂質(zhì)，中層為殘余的脂肪，底層的白色絮狀物為本實(shí)驗(yàn)所要提取的脂肪細(xì)胞外基質(zhì)（圖 1，C）。多次勻漿離心后，將全部的白色沉淀收集起來，分別加入到 Triton-X100、異丙醇和含有 DNA 酶和 RNA 酶的高滲氯化鈉中振蕩，再次離心后，最終得到一種黏稠的質(zhì)地柔軟的乳白色物質(zhì)（圖 1，D）。經(jīng)一系列脫細(xì)胞過程，最終得到的 DAT 的體積約為原始脂肪體積的 5% ~ 10%，得到的物質(zhì)呈乳白色，質(zhì)地柔軟易變形，不溶于水，便于器械操作，易被分離，能被導(dǎo)入不同形狀的模具中進(jìn)行進(jìn)一步處理。

圖 2 DAT 和組織組織的 HE 染色結(jié)果圖中 A、C 分別代表 DAT 組（圖 A bar=200μm，圖 C bar=20μm）；圖 B、D 代表脂肪組（圖B bar=200μm，圖 D bar=20μm）。3.2.2 Masson 染色Masson 染色中膠原纖維被染成藍(lán)色，照片中可以看到，DAT 喪失了脂肪組織的原有結(jié)構(gòu)，見不到任何細(xì)胞成分的殘留，可以看到大量膠原纖維的存在。這些膠原纖維是構(gòu)成 DAT 的主要成分，它們彼此交織成有空隙的條索（圖 3），維持著 DAT整體的穩(wěn)定性。

圖 3 DAT 和脂肪組織的 masson 染色結(jié)果圖中 A、C 分別代表 DAT 組（圖 A bar=200μm，圖 C bar=20μm）；圖 B、D 代表脂肪組（圖B bar=200μm，圖 D bar=20μm）。3.2.3 Gomori 染色，地衣紅染色和油紅 O 染色Gomori 染色結(jié)果顯示，DAT 經(jīng)脫細(xì)胞后，仍有少量網(wǎng)狀纖維的成分被保留下來（圖 4，A）。DAT 的地衣紅染色結(jié)果可以看到，在 DAT 組織中，也同樣保留了彈力纖維的成分（圖 4，C、D），這些皮下結(jié)締組織中常見的纖維成分，在經(jīng)過一系列的脫細(xì)胞過程后，均保留下來存在于 DAT 中。通過對殘余脂質(zhì)的油紅 O 染色，可以看到，在 DAT 中，已經(jīng)看不到脂質(zhì)成分的殘留（圖 4，E）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2828567