發(fā)布時間：2020-09-28 06:47

　　 紫杉醇(Taxol)是治療乳腺癌、卵巢癌及非小細胞肺癌等各種癌癥的常用藥物之一。自上世紀90年代臨床應(yīng)用以來,Taxol大大延長了腫瘤患者生存周期。但是,在治療過程中,腫瘤細胞逐漸對其失敏而出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象已成為多數(shù)患者化療失敗的主要原因。同樣,在乳腺癌治療過程中,乳腺癌細胞對Taxol耐藥的矛盾也日益突出,如何逆轉(zhuǎn)癌細胞對Taxol等腫瘤藥物的耐藥已經(jīng)成為臨床用藥的重要問題。多藥耐藥相關(guān)基因ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1)屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中最重要的轉(zhuǎn)運蛋白成員,經(jīng)糖基化后可編碼分子量為170KDa的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),ABCB1的分子結(jié)構(gòu)中具有的6個跨膜區(qū)可作為物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運通道;而其中的1個ATP結(jié)合位點可利用水解ATP釋放的能量將生物堿類、蒽環(huán)類及紫杉類等化療藥物從腫瘤細胞內(nèi)逆濃度方向泵出,從而減弱藥物的細胞毒性作用。目前已證實ABCB1高表達引起的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)是惡性腫瘤化療的一個重要瓶頸。MDR是指腫瘤細胞在長期接觸單一化療藥物的同時,會對結(jié)構(gòu)、功能及殺傷機制迥異的多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。多項實驗研究表明,與親本細胞株相比,微小RNAs(MicroRNAs,mi RNAs)在相應(yīng)腫瘤耐藥細胞株中的表達水平有明顯差異,說明miRNAs可能與腫瘤細胞耐藥性的形成密切相關(guān),調(diào)控其表達水平有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。已有研究表明:多種miRNAs通過影調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員的表達影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。miR-129-5p是miR-129家族中miR-129-1和miR-129-2的共同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,且為功能的主要體現(xiàn)者。miR-129-5p在乳腺癌細胞中低表達,屬于腫瘤抑制性miRNA,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、病理分級、臨床分期、耐藥性及預(yù)后密切相關(guān)。本實驗組通過生物信息網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測ABCB1為miR-129-5p的靶基因之一,并且有資料顯示,過表達miR-129-5p可通過靶向下調(diào)ABCB1提高胃癌細胞對長春新堿和阿霉素的藥物敏感性,但對于miR-129-5p在逆轉(zhuǎn)乳腺腫瘤耐藥中的作用,尤其是mi R-129-5p對耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控作用尚待進一步研究。目的本研究通過觀察miR-129-5p對Taxol作用下乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡的影響以及ABCB1、Bcl-2和Bax表達水平的變化,探討miR-129-5p能否通過調(diào)控ABCB1的表達影響乳腺癌MCF-7細胞對Taxol的敏感性,以期為闡明復雜的化療耐藥機制、篩選更有效的抗癌策略與治療靶點提供新的方向和實驗依據(jù)。材料和方法1研究對象本研究選用人乳腺癌MCF-7細胞系(購自美國ATCC細胞庫),使用RPMI1640完全培養(yǎng)基將其培養(yǎng)于37℃、5%CO_2的細胞培養(yǎng)箱中。2方法2.1實驗分組:本實驗根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?進行了以下2種分組。(1)篩選藥物作用濃度和時間:分為無藥物組和不同濃度Taxol(1.95nM、3.9nM、7.81nM、15.63nM、31.25nM、62.5nM、250nM和1000nM)刺激培養(yǎng)組,作用時間分別為24h、48h和72h。(2)過表達miR-129-5p后Taxol對MCF-7細胞的作用:分為空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、miR-NC+Taxol組、miR-129-5p mimics組和miR-129-5p mimics+Taxol組。2.2細胞轉(zhuǎn)染:待細胞生長密度達到70%~80%時,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-129-5p mimics及其陰性對照物(miR-NC)轉(zhuǎn)染入MCF-7細胞中。2.3 CCK-8:采用CCK-8方法檢測miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對MCF-7細胞增殖抑制率的影響。2.4流式細胞術(shù):采用流式細胞術(shù)檢測miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對MCF-7細胞總凋亡率的影響。2.5細胞熒光染色:采用吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色技術(shù)觀察miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對MCF-7細胞凋亡的影響。2.6 qRT-PCR:采用qRT-PCR檢測miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對MCF-7細胞中miR-129-5p和ABCB1、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量的影響。2.7 Western Blot:采用Western Blot檢測miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對MCF-7細胞中ABCB1、Bcl-2和Bax蛋白相對表達量的影響。3統(tǒng)計學處理本研究所得數(shù)據(jù)均以?x±s表示,用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間細胞生長抑制率比較時采用獨立樣本t檢驗或者校正t檢驗,多組間細胞凋亡、目的基因的mRNA和蛋白水平比較時,采用單因素方差(One Way ANOVA)分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以α=0.05作為檢驗水準。結(jié)果1 Taxol對MCF-7細胞作用濃度和作用時間的篩選MCF-7細胞在不同濃度Taxol作用下,根據(jù)其在24h、48h和72h增殖抑制率確定本研究后續(xù)實驗中Taxol的作用濃度為7.81nM(介于IC_(25)~IC_(30)),培養(yǎng)時間為48 h。2過表達miR-129-5p后Taxol對MCF-7細胞增殖的影響CCK8檢測結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細胞的增殖抑制率明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3過表達miR-129-5p后Taxol對MCF-7細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:與mi R-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組細胞凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。細胞熒光染色結(jié)果顯示:miR-129-5p mimics+Taxol組中的細胞核染色質(zhì)多數(shù)著橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;miR-NC+Taxol組中的細胞核染色質(zhì)多著綠色呈固縮狀或破碎狀,少數(shù)細胞核染色質(zhì)著橘紅色。4過表達miR-129-5p后Taxol對MCF-7細胞中ABCB1mRNA及其蛋白相對表達量的影響qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細胞中ABCB1 mRNA及其蛋白的相對表達量降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5過表達miR-129-5p后對Taxol對MCF-7細胞中Bcl-2、Bax mRNA及其蛋白相對表達量的影響qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細胞中Bcl-2 mRNA及其蛋白的相對表達量降低;而Bax mRNA及其蛋白的相對表達量增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論mi R-129-5p可以通過抑制ABCB1的表達,提高乳腺癌MCF-7細胞對Taxol敏感性。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

圖 3.1 不同濃度的 Taxol 與作用時間對 MCF-7 細胞的生長抑制率表 3.2 不同作用時間下 Taxol 的 IC 值（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

圖 3.1 不同濃度的 Taxol 與作用時間對 MCF-7 細胞的生長抑制率表 3.2 不同作用時間下 Taxol 的 IC 值間（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

-129-5p mimics 轉(zhuǎn)染效率染 miR-129-5p mimics 后， miR-129-5p mimics 中 miR-1140.67±0.13）高于 miR-NC 組（1.01±0.06）140 倍，差異0.05），而 miR-NC 組與空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組之間無統(tǒng)表 3.3，圖 3.3。說明 miR-129-5p 可以有效轉(zhuǎn)染入 MCF-7表 3.3 miR-129-5p 的相對表達量（ x±s）組別 miR-129-5p空白對照組 1.00±0.07轉(zhuǎn)染試劑組 0.93±0.03miR-NC 組 1.01±0.06miR-129-5pmimics 組 140.67±0.13*F 21.6×105P <0.001示與 miR-NC 組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

【參考文獻】

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1 Vibeke Andersen;Katrine Svenningsen;Lina Almind Knudsen;Axel Kornerup Hansen;Uffe Holmskov;Allan Stensballe;Ulla Vogel;;Novel understanding of ABC transporters ABCB1/MDR/P-glycoprotein, ABCC2/MRP2, and ABCG2/BCRP in colorectal pathophysiology[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

2 趙遵蘭;蔡穎;王洋洋;夏春磊;李從新;陳素蓮;楊清玲;陳昌杰;;微小RNA-21對人乳腺癌細胞株紫杉醇耐藥性的影響及其機制[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2015年04期

3 陳萬青;鄭榮壽;;中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J];中國腫瘤臨床;2015年13期

4 劉國科;趙健;;腫瘤微環(huán)境與腫瘤耐藥[J];現(xiàn)代免疫學;2015年03期

5 Armel Hervé Nwabo Kamdje;Paul Faustin Seke Etet;Lorella Vecchio;Richard Simo Tagne;Jeremie Mbo Amvene;Jean-Marc Muller;Mauro Krampera;Kiven Erique Lukong;;New targeted therapies for breast cancer: A focus on tumor microenvironmental signals and chemoresistant breast cancers[J];World Journal of Clinical Cases;2014年12期

6 袁佳;葉晶瑩;林玲;;紫杉醇抗腫瘤作用研究[J];海峽藥學;2014年12期

7 柳青;劉雪娟;陳玉娟;汪靜;;塞來昔布聯(lián)合紫杉醇對人乳腺癌MCF-7/Taxol耐藥細胞株多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機制的探討[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2011年03期

本文編號：2828465