紫杉醇(Taxol)是治療乳腺癌、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌等各種癌癥的常用藥物之一。自上世紀(jì)90年代臨床應(yīng)用以來(lái),Taxol大大延長(zhǎng)了腫瘤患者生存周期。但是,在治療過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)其失敏而出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象已成為多數(shù)患者化療失敗的主要原因。同樣,在乳腺癌治療過(guò)程中,乳腺癌細(xì)胞對(duì)Taxol耐藥的矛盾也日益突出,如何逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)Taxol等腫瘤藥物的耐藥已經(jīng)成為臨床用藥的重要問(wèn)題。多藥耐藥相關(guān)基因ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1)屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員,經(jīng)糖基化后可編碼分子量為170KDa的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),ABCB1的分子結(jié)構(gòu)中具有的6個(gè)跨膜區(qū)可作為物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道;而其中的1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)可利用水解ATP釋放的能量將生物堿類(lèi)、蒽環(huán)類(lèi)及紫杉類(lèi)等化療藥物從腫瘤細(xì)胞內(nèi)逆濃度方向泵出,從而減弱藥物的細(xì)胞毒性作用。目前已證實(shí)ABCB1高表達(dá)引起的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)是惡性腫瘤化療的一個(gè)重要瓶頸。MDR是指腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸單一化療藥物的同時(shí),會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)、功能及殺傷機(jī)制迥異的多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明,與親本細(xì)胞株相比,微小RNAs(MicroRNAs,mi RNAs)在相應(yīng)腫瘤耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)水平有明顯差異,說(shuō)明miRNAs可能與腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成密切相關(guān),調(diào)控其表達(dá)水平有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。已有研究表明:多種miRNAs通過(guò)影調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。miR-129-5p是miR-129家族中miR-129-1和miR-129-2的共同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,且為功能的主要體現(xiàn)者。miR-129-5p在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),屬于腫瘤抑制性miRNA,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、病理分級(jí)、臨床分期、耐藥性及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)生物信息網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)ABCB1為miR-129-5p的靶基因之一,并且有資料顯示,過(guò)表達(dá)miR-129-5p可通過(guò)靶向下調(diào)ABCB1提高胃癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和阿霉素的藥物敏感性,但對(duì)于miR-129-5p在逆轉(zhuǎn)乳腺腫瘤耐藥中的作用,尤其是mi R-129-5p對(duì)耐藥相關(guān)蛋白的調(diào)控作用尚待進(jìn)一步研究。目的本研究通過(guò)觀察miR-129-5p對(duì)Taxol作用下乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及ABCB1、Bcl-2和Bax表達(dá)水平的變化,探討miR-129-5p能否通過(guò)調(diào)控ABCB1的表達(dá)影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)Taxol的敏感性,以期為闡明復(fù)雜的化療耐藥機(jī)制、篩選更有效的抗癌策略與治療靶點(diǎn)提供新的方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1研究對(duì)象本研究選用人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系(購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)),使用RPMI1640完全培養(yǎng)基將其培養(yǎng)于37℃、5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2方法2.1實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?進(jìn)行了以下2種分組。(1)篩選藥物作用濃度和時(shí)間:分為無(wú)藥物組和不同濃度Taxol(1.95nM、3.9nM、7.81nM、15.63nM、31.25nM、62.5nM、250nM和1000nM)刺激培養(yǎng)組,作用時(shí)間分別為24h、48h和72h。(2)過(guò)表達(dá)miR-129-5p后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用:分為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照)、miR-NC+Taxol組、miR-129-5p mimics組和miR-129-5p mimics+Taxol組。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%~80%時(shí),利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-129-5p mimics及其陰性對(duì)照物(miR-NC)轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中。2.3 CCK-8:采用CCK-8方法檢測(cè)miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率的影響。2.4流式細(xì)胞術(shù):采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞總凋亡率的影響。2.5細(xì)胞熒光染色:采用吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色技術(shù)觀察miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。2.6 qRT-PCR:采用qRT-PCR檢測(cè)miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞中miR-129-5p和ABCB1、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。2.7 Western Blot:采用Western Blot檢測(cè)miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染前后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞中ABCB1、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究所得數(shù)據(jù)均以?x±s表示,用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者校正t檢驗(yàn),多組間細(xì)胞凋亡、目的基因的mRNA和蛋白水平比較時(shí),采用單因素方差(One Way ANOVA)分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1 Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞作用濃度和作用時(shí)間的篩選MCF-7細(xì)胞在不同濃度Taxol作用下,根據(jù)其在24h、48h和72h增殖抑制率確定本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Taxol的作用濃度為7.81nM(介于IC_(25)~IC_(30)),培養(yǎng)時(shí)間為48 h。2過(guò)表達(dá)miR-129-5p后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3過(guò)表達(dá)miR-129-5p后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:與mi R-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組細(xì)胞凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示:miR-129-5p mimics+Taxol組中的細(xì)胞核染色質(zhì)多數(shù)著橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;miR-NC+Taxol組中的細(xì)胞核染色質(zhì)多著綠色呈固縮狀或破碎狀,少數(shù)細(xì)胞核染色質(zhì)著橘紅色。4過(guò)表達(dá)miR-129-5p后Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞中ABCB1mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細(xì)胞中ABCB1 mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5過(guò)表達(dá)miR-129-5p后對(duì)Taxol對(duì)MCF-7細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與miR-NC+Taxol組比較,miR-129-5p mimics+Taxol組MCF-7細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低;而B(niǎo)ax mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論mi R-129-5p可以通過(guò)抑制ABCB1的表達(dá),提高乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)Taxol敏感性。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R737.9
【部分圖文】：

圖 3.1 不同濃度的 Taxol 與作用時(shí)間對(duì) MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率表 3.2 不同作用時(shí)間下 Taxol 的 IC 值（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

圖 3.1 不同濃度的 Taxol 與作用時(shí)間對(duì) MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率表 3.2 不同作用時(shí)間下 Taxol 的 IC 值間（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

-129-5p mimics 轉(zhuǎn)染效率染 miR-129-5p mimics 后， miR-129-5p mimics 中 miR-1140.67±0.13）高于 miR-NC 組（1.01±0.06）140 倍，差異0.05），而 miR-NC 組與空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組之間無(wú)統(tǒng)表 3.3，圖 3.3。說(shuō)明 miR-129-5p 可以有效轉(zhuǎn)染入 MCF-7表 3.3 miR-129-5p 的相對(duì)表達(dá)量（ x±s）組別 miR-129-5p空白對(duì)照組 1.00±0.07轉(zhuǎn)染試劑組 0.93±0.03miR-NC 組 1.01±0.06miR-129-5pmimics 組 140.67±0.13*F 21.6×105P <0.001示與 miR-NC 組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2828465