【摘要】：目的:探究以木質(zhì)素(Lignin)和聚乳酸(PLA)用靜電紡絲技術(shù)制備納米復(fù)合纖維膜的可行性,研究其體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力,篩選對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)最佳組植入SD大鼠(Sprague-Dawley)的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型驗(yàn)證納米復(fù)合纖維膜修復(fù)大面積淺表層軟骨缺損的效果。方法:第一部分,納米纖維膜的合成。先將木質(zhì)素和PLA合成LP共聚物,再以不同比例與PLA混合,用靜電紡絲技術(shù)制成納米復(fù)合纖維膜。對(duì)其進(jìn)行材料的表征:掃描電鏡拍照,觀察纖維形態(tài)并計(jì)算纖維直徑;測(cè)量拉伸強(qiáng)度和楊氏模量,驗(yàn)證纖維膜的力學(xué)強(qiáng)度;蠕變恢復(fù)測(cè)試是分析聚合物膜彈性。第二部分,納米復(fù)合纖維膜體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化研究。根據(jù)不同比例的納米復(fù)合纖維膜作為實(shí)驗(yàn)組并建立爬片組作為空白對(duì)照,提取SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后,接種到各個(gè)纖維膜組以及爬片組中,培養(yǎng)7天后,用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細(xì)胞和支架的粘附形態(tài);培養(yǎng)21天后,鈣黃綠素素/碘化丙啶染色和DNA增殖檢測(cè)纖維膜的支持生長(zhǎng)能力,糖胺聚糖(GAG)的分泌量檢測(cè),鬼筆環(huán)肽/33258熒光染色,Ⅱ型膠原免疫熒光染色等檢測(cè)成軟骨分化特征;分別選7、14和21天樣品檢測(cè)軟骨相關(guān)特征基因的表達(dá)(熒光定量PCR)驗(yàn)證成軟骨分化能力。第三部分,納米復(fù)合纖維膜體內(nèi)修復(fù)大鼠關(guān)節(jié)淺表層軟骨缺損實(shí)驗(yàn)。打開(kāi)SD大鼠關(guān)節(jié)腔,用手持小電鉆磨掉一個(gè)的軟骨缺口,制備大鼠膝關(guān)節(jié)淺表層軟骨缺損模型,植入篩選出的最優(yōu)組細(xì)胞-納米復(fù)合纖維膜,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組;在術(shù)后2、4和6周進(jìn)行取材和收樣,進(jìn)行大體觀察評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分,多聚甲醛固定后石蠟包埋切片染色,觀察修復(fù)情況。結(jié)果:成功合成了LP共聚物并通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備了一系列的PLLA/Lignin納米復(fù)合纖維膜,通過(guò)材料表征實(shí)驗(yàn)測(cè)量纖維直徑范圍從最大的712±63nm到最小的350±80nm;拉伸強(qiáng)度最大3.49±0.20MPa,最低,為2.49±0.14MPa;楊氏模量最為56.8±1.6MPa,最大為66.8±2.8MPa等。體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨的實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞DNA增殖檢測(cè)和Calcein-AM/PI熒光染色檢測(cè)的是細(xì)胞的增殖和活性,PLLA-Ligp30%組細(xì)胞增殖和活性最好;掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料中粘附和生長(zhǎng)情況,細(xì)胞與各組纖維膜都能較好的粘附生長(zhǎng),其中PLLA-Ligp30%鋪展和形態(tài)改變最為明顯,有一定的分化趨勢(shì);GAG分泌量檢測(cè),二型膠原免疫熒光染色和PCR結(jié)果顯示,各纖維膜組材料相比空白爬片組均有一些促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的趨勢(shì),COLⅡ、SOX9、和ACAN等軟骨特征性基因的表達(dá)量明顯較高,綜合而言其中PLLA-Ligp30%組的誘導(dǎo)效果最好;通過(guò)纖維狀肌動(dòng)蛋白分泌檢測(cè)觀察細(xì)胞核周?chē)?dòng)蛋白骨架的交織情況,PLLA-Ligp30%納米復(fù)合纖維膜組的肌動(dòng)蛋白骨架與材料纖維充分交織,與上述檢測(cè)具有一致性。通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察,植入了細(xì)胞-納米復(fù)合纖維膜組的大鼠關(guān)節(jié),其軟骨缺損修復(fù)效果明顯好于對(duì)照組,且具有抑制關(guān)節(jié)炎癥產(chǎn)生的現(xiàn)象;組織學(xué)染色檢測(cè)也證明了大體觀察的結(jié)果,用間充質(zhì)干細(xì)胞-納米復(fù)合纖維膜結(jié)合可以在體內(nèi)進(jìn)行成軟骨分化的誘導(dǎo),促進(jìn)關(guān)節(jié)淺表層軟骨缺損修復(fù)。結(jié)論:將木質(zhì)素-PLA共聚物用靜電紡絲技術(shù)成功制備了不同比例成分的納米復(fù)合纖維膜。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明其具有明顯的成軟骨分化能力并在植入體內(nèi)后能夠修復(fù)淺表層的關(guān)節(jié)軟骨缺損。通過(guò)本次研究,可以為創(chuàng)新復(fù)合生物材料提供方向,為軟骨誘導(dǎo)性材料的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R68
【圖文】：

依據(jù)掃描電鏡觀察結(jié)果圖 1-2 所示，所有纖維均表現(xiàn)出均勻且無(wú)珠粒的納米尺寸形態(tài)，各組的纖維直徑范圍從最大的純 PLLA 的 712±63nm 到最小的 PLLA/Ligp50%的 350±80nm，圖 1-3A 顯示隨著木質(zhì)素比例的增加，纖維直徑逐步減�。粓D 1-1 LP 共聚物的合成路線Fig.1-1 Synthesis steps of lignin-PLA (LP) copolymers

納米復(fù)合纖維膜誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化研究 2015 級(jí)碩士學(xué)位論文納米纖維膜的楊氏模量測(cè)試結(jié)果如圖 1-3C 所示，PLLA 組的楊氏模量為56.8±1.6 MPa 而 PLLA/Ligp50%組的楊氏模量最大，為 66.8±2.8MPa。添加了 LP 共聚物的組中僅 PLLA/Ligp10%和 PLLA/Ligp30%組模量略小于PLLA 組，其他各組均有所升高。

4 討論在開(kāi)發(fā)和合成新的軟骨誘導(dǎo)材料時(shí)，細(xì)胞所處的微環(huán)境及材料的表征結(jié)構(gòu)都需要有清楚的掌握[30]。在這項(xiàng)研究中，結(jié)合了天然材料和人工合成生物材料的優(yōu)點(diǎn)[31]，先將天然材料木質(zhì)素接枝 PLA 形成 LP 共聚物，把這種 LP 共聚物與人工合成材料 PLLA 混合[21]，成功使用靜電紡絲技術(shù)獲得網(wǎng)圖 1-4 PLLA / LP 納米纖維的表征結(jié)果圖（A）蠕變和恢復(fù)應(yīng)變時(shí)間曲線；（B）蠕變順應(yīng)性時(shí)間曲線。Fig.1-4 Characterization of PLLA/LP nanofibers: (A) creep and recovery strain time curves; (B)Creep compliance time curves.

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本文編號(hào)：2787667