【摘要】：[目的]通過構(gòu)建腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor, BDNF)基因過表達慢病毒載體,將BDNF載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),觀察與脊髓神經(jīng)細胞共培養(yǎng)下,BDNF轉(zhuǎn)染的BMSCs中過量表達產(chǎn)物對移植細胞BMSCs體外分化的影響,轉(zhuǎn)染BDNF的BMSCs在體外能否對脊髓神經(jīng)細胞具有保護作用,探討轉(zhuǎn)染BDNF的BMSCs體內(nèi)實驗的基礎(chǔ),研究細胞移植替代治療及基因治療脊髓疾病的新途徑。[方法]一、兔骨髓基質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、鑒定1、BMSCs的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)；2、流式細胞儀鑒定培養(yǎng)的BMSCs,進行CD29、CD34、CD45、CD90染色；二、兔BDNF基因過表達和干擾慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BMSCs1、從日本大耳兔脊髓中提取RNA,合成cDNA,構(gòu)建BDNF基因過表達和干擾慢病毒載體并測序、酶切鑒定；2、采用定量PCR、Western blot實驗進行BDNF過表達、干擾慢病毒載體最佳質(zhì)粒篩選；3、BDNF過表達質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒慢病毒包裝,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BMSCs;4、RT-PCR、Western Blotting分別檢測轉(zhuǎn)染的BMSCs中BDNF基因、蛋白表達；三、兔BDNF基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSCs與脊髓神經(jīng)細胞共培養(yǎng)1、兔脊髓神經(jīng)細胞的提取、分離、原代培養(yǎng)；2、采用免疫組化法鑒定培養(yǎng)的兔脊髓神經(jīng)細胞,進行NSE染色；3、共培養(yǎng)實驗分為四組：A組：脊髓神經(jīng)細胞與未轉(zhuǎn)染的BMSCs培養(yǎng)；B組：脊髓神經(jīng)細胞與轉(zhuǎn)染BDNF過表達基因的BMSCs培養(yǎng)；C組：脊髓神經(jīng)細胞與轉(zhuǎn)染BDNF干擾基因的BMSCs培養(yǎng)；D組：脊髓神經(jīng)細胞與轉(zhuǎn)染空病毒載體的BMSCs培養(yǎng)。4、采用Transwell雙層培養(yǎng)皿進行轉(zhuǎn)染的BMSC細胞與脊髓神經(jīng)細胞共培養(yǎng)；5、RT-PCR、Western Blotting分別檢測共培養(yǎng)中BDNF基因、蛋白表達；6、采用免疫組化法鑒定共培養(yǎng)中向神經(jīng)元樣細胞分化的BMSCs,進行Nestin. NSE染色；四、結(jié)果檢測采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,所有數(shù)據(jù)均以x±s表示,數(shù)據(jù)組間差異用獨立樣本t檢驗分析,組內(nèi)差異用單因素方差分析,P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]1、BMSCs的培養(yǎng)、鑒定BMSCs原代培養(yǎng)后見貼壁生長的細胞數(shù)量逐漸增多,細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形,可見成纖維樣細胞散布于培養(yǎng)瓶底,并有集落形成,細胞圍繞中心呈漩渦狀排列。細胞融合達80%時即可再次傳代,BMSC細胞傳至第3代時進行流式細胞儀鑒定,基本不表達造血干細胞的表面標志CD34、CD45,但CD29和CD90陽性。2、BDNF基因慢病毒載體構(gòu)建、鑒定及最佳質(zhì)粒篩選構(gòu)建的慢病毒進行測序,以NCBI的基因進行比對,其所有基因均能100%匹配,酶切驗證表達重組質(zhì)粒,PCR驗證干擾重組質(zhì)粒,證實目的基因已插入重組質(zhì)粒。QPCR、Western blot實驗進行最佳質(zhì)粒篩選,過表達組BDNF明顯表達,干擾組BDNF明顯減少,與對照組相比具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。3. BDNF基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs及RT-PCR、Western Blotting檢測免疫組化染色顯示BDNF基因慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染BMSCs, RT-PCR、 Western Blotting檢測基因、蛋白的表達顯示干擾質(zhì)粒BDNF表達最少,BDNF過表達基因轉(zhuǎn)染的BMSCs中BDNF明顯高于其他組(p0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4、兔脊髓神經(jīng)細胞的培養(yǎng)、鑒定脊髓神經(jīng)細胞培養(yǎng)后細胞大部分貼壁,胞體增大,呈圓形或橢圓形,胞體周圍的突起伸展并延長,形成單極、雙極或多極突起。采用免疫組化法鑒定,培養(yǎng)3天的神經(jīng)細胞經(jīng)NSE免疫熒光染色,陽性率達86%以上。5、BDNF基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSCs與脊髓神經(jīng)細胞共培養(yǎng)RT-PCR、Western Blotting分別檢測共培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染的BMSCs BDNF基因、蛋白表達,C組BDNF mRNA及蛋白表達最少,B組BDNF mRNA及蛋白表達明顯高于其他組,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。共培養(yǎng)后,B組大部分BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化,而A、C、D組細胞形態(tài)變化較小。采用免疫組化法鑒定共培養(yǎng)中分化的BMSCs,定量計數(shù)分析B組表達NSE約為(89.49±1.25)%,Nestin約為(91.20±2.50)%,C組極少量表達NSE和Nestin, A組與D組少量表達NSE和Nestin。B組、C組與A組比較P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；D組與A組比較P0.05,無明顯差異。[結(jié)論]1、BMSC可以在體外分離、培養(yǎng)、傳代、擴增,經(jīng)流式細胞儀鑒定證實分離培養(yǎng)的細胞為BMSC。2、兔BDNF基因過表達慢病毒載體構(gòu)建成功,成功轉(zhuǎn)染BMSCs,有效增強BMSCs中BDNF基因的表達,能夠穩(wěn)定表達BDNF蛋白。3、與脊髓神經(jīng)細胞共培養(yǎng)下,BDNF基因過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSCs高表達BDNF mRNA,在BMSCs分泌物中BDNF蛋白分泌較多,促進共培養(yǎng)的BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化,促進其突起的形成和生長,對脊髓神經(jīng)細胞有保護作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 端禮榮,吳全義,張志堅,姜平;堿性成纖維細胞生長因子對培養(yǎng)大鼠胚胎脊髓神經(jīng)細胞的作用[J];中國生化藥物雜志;2004年05期

2 李芳,何鳳慈,李東紅,龍在云,廖維宏;胎鼠脊髓神經(jīng)細胞的分離培養(yǎng)與生長分化[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1993年06期

3 梁U，

本文編號：2263326