【摘要】 目的：通過基于人類全基因組外顯子芯片測序技術(shù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GenomeWide Association Studies，GWAS），檢測口腔癌患者原發(fā)灶組織、其頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織以及健康志愿者外周血的單核苷酸多態(tài)性（Single NucleotidePolymorphisms，SNP）。同時，尋找取口腔癌易感基因以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，為進一步實驗打下基礎(chǔ)。方法：1、采集10例晚期病人的口腔癌原發(fā)灶組織及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織以及24個健康志愿者的外周血樣本，分別設(shè)立為原發(fā)灶組、轉(zhuǎn)移組和健康對照組；2、提取樣本DNA并在基因芯片上實施全基因組外顯子測序；3、測序后，通過樣品表Genomestudio可以實現(xiàn)原始數(shù)據(jù)有選擇性的數(shù)據(jù)提取，進行基因分型數(shù)據(jù)可視化和簡要分析；采用PLINK軟件和haploview軟件對測序結(jié)果進行病例對照組間比較，實現(xiàn)全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）；通過卡方檢驗和多重校正方法比較兩組樣品基因分型信息，篩選出口腔癌易感基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的SNP位點（p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。結(jié)果：1、實驗成功地實現(xiàn)了共44個樣本的基因芯片全外顯子測序，包括24個健康志愿者的外周血樣本、10例口腔癌病人的10個口腔癌原發(fā)灶組織及10個對應(yīng)的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。2、通過Genomestudio軟件實現(xiàn)了測序數(shù)據(jù)有選擇性的可視化和簡要分析。3、原發(fā)灶組與轉(zhuǎn)移組的比較（10個口腔癌原發(fā)灶組織與10個對應(yīng)的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織）、原發(fā)灶組與健康對照組的比較（10個口腔癌原發(fā)灶組織和24個健康對照）和轉(zhuǎn)移組與健康對照組比較（10個口腔癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織和24個健康對照）的卡方檢驗結(jié)果，經(jīng)校正后均出現(xiàn)卡方值的p>0.05，沒有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異的SNP。4、在口腔癌病例組（10個口腔癌轉(zhuǎn)移癌樣本和10個口腔癌原發(fā)灶樣本）與健康對照組的比較中，從選定的242901個與人類疾病有關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽SNP中篩選出了622個SNP位點（未校正前卡方的p<0.005），經(jīng)過多重校正共同確定了2個SNP位點（exm530670代表NM₀05514、p=0.025，屬于染色體6p21.3上人類蛋白質(zhì)編碼基因HLA-B；和exm1415896代表NM₁98534.2、p=0.036，屬于人類蛋白質(zhì)編碼基因C19orf45）與口腔癌有高度相關(guān)性（Bonferroni adjustion等多重校正后，均得p<0.05）。其中C19orf45被已發(fā)表的外文文獻證實在腫瘤和人誘導(dǎo)干細胞中發(fā)生了突變，而HLA-B被直接證實與頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)病和腫瘤轉(zhuǎn)移都存在緊密相關(guān)。結(jié)論：人類蛋白質(zhì)編碼基因HLA-B和C19orf45與口腔癌存在緊密關(guān)聯(lián)。通過這個初步研究我們掌握了全基因組外顯子芯片測序技術(shù)和測序結(jié)果分析方法，為進一步尋找口腔癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其功能打下了基礎(chǔ)。 

前 言

針對口腔癌的診斷和治療工作進展，借助 WHO 的說法，有賴于腫瘤研究的發(fā)展。有研究認為 u-PA 基因 rs2227564 C/T 多態(tài)性與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1]。而且血管內(nèi)皮生長因子在+936 T 等位基因－2578 C/A SNP 和（或）其他 SNP 與口腔鱗狀細胞癌聯(lián)系緊密[2]。由于在 MDM2 啟動子的單核苷酸多態(tài)性能減弱 p53 腫瘤抑制途徑并加速人類腫瘤的形成，研究人員提出了以 MDM2 基因SNP309 作為一個腫瘤發(fā)生限速事件的腫瘤模型[3]。在由嚼檳榔引起的口腔鱗狀細胞癌中 MDM2 基因 SNP 309 和 p53 突變對腫瘤形成起協(xié)同作用，MDM2 基因 SNP309 被認為促進了有 p53 缺陷的惡性腫瘤的早期形成。在對另外 351 例由嚼檳榔引起的口腔鱗狀細胞癌患者的檢查中，發(fā)現(xiàn) MDM2 基因多態(tài)性（SNP 309，G 等位基因變異）與體細胞 p53 突變共同增加了口腔癌細胞淋巴結(jié)膜外擴散的概率，并與腫瘤患者治療預(yù)后不良有關(guān)，因此，認為 MDM2 基因 SNP 309 和 p53 突變對口腔癌進展起協(xié)同促進作用[4]。在與煙草有關(guān)的口腔癌高風(fēng)險印度人中，進行患口腔癌風(fēng)險與 hMLH1 基因啟動子單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究，科研人員選擇 242例與煙草有關(guān)的口腔鱗狀細胞癌患者和 205 例健康對照者進行基因分型，發(fā)現(xiàn)hMLH1-93 A＞G 多態(tài)性的印度人患與煙草相關(guān)口腔鱗狀細胞癌的風(fēng)險很高，并認為這一基因多態(tài)性可以用于口腔癌高風(fēng)險人群的篩查[5]。因此，基因的變異被認為對口腔癌的發(fā)生發(fā)展起重要的作用，對口腔癌組織細胞基因的研究就十分有必要。
外顯子是人類基因的一部分，包含著合成蛋白質(zhì)所需要的信息，都是基因功能區(qū)序列，而且全部外顯子占人類基因組的量不到 2%。外顯子測序是利用靶向序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域 DNA 捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，實現(xiàn)對外顯子序列有針對性檢測的基因組分析方法[6, 8, 12]�；蛐酒�(genechip)又稱 DNA 芯片，是通過微加工技術(shù)將大量帶有已知生物信息的探針分子固定于芯片底板上（通常每平方厘米點陣密度高于 400 基因序列探針分子），然后與人體樣品 DNA 分子進行雜交反應(yīng)，通過反應(yīng)后雜交信號強度和位置信息的檢測進而確定 DNA 分子的生物信息。在生物信息學(xué)分析手段的支持和幫助下，外顯子組測序讀取精度得到了提高，并在致病基因發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮作用[7]。該技術(shù)測序精度高，能檢測到個別堿基的替換、插入、缺失、拷貝數(shù)變異甚至整個外顯子組染色體轉(zhuǎn)位[7]。由于基因芯片外顯子組測序能有針對性地選擇預(yù)先指定靶向外顯子序列，采用該技術(shù)可以低誤差、高通量地檢測組織細胞基因表達情況，能反映疾病與基因的大量相關(guān)關(guān)系，并且遠比全基因組序列測序更簡便、經(jīng)濟、高效，因此是一種疾病基因變異高效分析的策略[6-8]。
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材料與方法

1．1 腫瘤標(biāo)本和血液標(biāo)本采集
我們選取患口腔癌并發(fā)生口腔癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌者，同時符合未經(jīng)放、化療治療的首次就診患者，采集口腔癌原發(fā)灶組織、轉(zhuǎn)移癌組織標(biāo)本及相關(guān)臨床資料。共收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 10 例口腔癌患者的原發(fā)灶組織和轉(zhuǎn)移癌癌組織；以及參與實驗的 24 個健康志愿者的外周血標(biāo)本。使用的所有標(biāo)本均獲得病人的知情同意，并于術(shù)前或?qū)嶒炃昂炇饦?biāo)本使用同意書。所有口腔癌患者均經(jīng)手術(shù)，病理確診為各種口腔癌并發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有組織標(biāo)本均在手術(shù)后 1 小時內(nèi)分區(qū)保存于-80 度低溫冰箱中，未經(jīng)福爾馬林固定或石蠟包埋等影響。經(jīng)過篩選和 DNA 測定，最終選取 10 例口腔癌患者的原發(fā)灶組織和轉(zhuǎn)移癌癌組織，做了外顯子基因芯片上樣；同時成功選取參與實驗的 24 個健康志愿者的外周血標(biāo)本外顯子基因芯片上樣；整個實驗實現(xiàn)了 44 個標(biāo)本的外顯子基因芯片上樣，為外顯子測序、原始數(shù)據(jù)的可視化和分析奠定了基礎(chǔ)。
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1.2 DNA 樣品采集
1.2.1 實驗材料
實驗儀器：1.5ml 離心管、2mL 的微量離心管、-80℃低溫冰箱、水浴鍋兩個、液氮罐、剪刀、200μL 移液槍及槍頭、20μL 移液槍及槍頭、離心機（20,000×g (14,000 rpm)）、鑷子、振蕩器、精密質(zhì)量電子稱、砂漿研缽和研杵、勻化器、搖床、攪拌器、Nano drop DNA 濃度測量儀、260/280 分光光度計。
實驗試劑：QIAamp 試劑盒(凱捷 QIAGEN 組織 DNA 提取純化試劑盒)，AL 緩沖液和 ATL 緩沖液、96-100%乙醇、PBS、蛋白酶 k、 AE 緩沖液、AW1 和 AW2 緩沖液、液氮。
1.2.2 實驗方法
一、口腔癌樣本 DNA 提取
口腔癌組織標(biāo)本要求：
1、組織采集后用-80℃急速冷凍（有利于較好保存 DNA，獲得較好的 DNA）。
2、組織樣品總重量大于 30mg，剪成組織塊后但單個組織塊重不大于 30mg。準(zhǔn)備事項：
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統(tǒng)計學(xué)方法......................... 32 
實驗結(jié)果........................... 32-55 

討論 

我們的研究成功地發(fā)現(xiàn) 622 個人類蛋白質(zhì)編碼基因與口腔癌存在密切關(guān)聯(lián)，其中 HLA-B 和 C19orf45 與口腔癌的關(guān)系通過了多重統(tǒng)計學(xué)驗證，它們可能與口腔癌存在關(guān)聯(lián)，，是我們研究口腔癌新基因最重要的候選基因。目前已經(jīng)被證實頻繁發(fā)生突變的頭頸部腫瘤基因有 TP53、NOTCH1、CDKN2A、PIK3CA 和HRAS 等[48]，我們的研究拓展了口腔癌的基因譜，增加了 HLA-B 和 C19orf45這 2 個基因，為下一步基因功能驗證實驗提供研究對象。
在單純轉(zhuǎn)移癌與原發(fā)癌的比較中，GWAS 無法獲得校正后有統(tǒng)計學(xué)意義的SNP 位點，我們也就無法獲知口腔癌從原發(fā)灶到轉(zhuǎn)移癌的過程中發(fā)生的基因變化（差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義）。這種無統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果同樣出現(xiàn)在原發(fā)灶與健康對照、轉(zhuǎn)移癌與健康對照的比較中，這種結(jié)果可能與研究樣本量不足有關(guān)。同時，GWAS 研究是有缺陷的，它存在人群分層等挑戰(zhàn)[30, 47]。GWAS 只是建立在數(shù)學(xué)相關(guān)上，而不是生物學(xué)基礎(chǔ)的相關(guān)，無法證明基因在疾病中的作用[47]；同時，GWAS 得出基因位點與疾病有關(guān)或無關(guān)，還受人群分層影響[47]。在口腔癌病例組（合并 10 個原發(fā)灶和 10 個轉(zhuǎn)移癌）與對照組（24 個外周血樣本組）比較后，實驗結(jié)果出現(xiàn)了有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，這一現(xiàn)象可能反映了 GWAS 分析受到樣品數(shù)量等因素的干擾。然而，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)校正結(jié)果，我們有理由相信，這兩個新發(fā)現(xiàn)基因與口腔癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的。
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結(jié)論

1、通過該實驗，我們掌握了人類全基因組外顯子芯片測序技術(shù)，能檢測并分析口腔癌 SNP 信息，為口腔癌的進一步研究提供有力手段。
2、本實驗無法直接找到與口腔癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，可能與試驗樣本量較少有關(guān)。
3、實驗發(fā)現(xiàn)的 HLA-B 和 C19orf45 基因的變異可能口腔癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以作為進一步研究的候選基因。
人類蛋白質(zhì)編碼基因 HLA-B 和 C19orf45 與口腔癌存在緊密關(guān)聯(lián)。通過這個初步研究我們掌握了全基因組外顯子芯片測序技術(shù)和測序結(jié)果分析方法，為進一步尋找口腔癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其功能打下了基礎(chǔ)。
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參考文獻（略）